植物内生微生物研究发展探索

1我早期的植物内生微生物研究

早期的研究中以植物内生菌为题报道的绝大部分都是非豆科植物根系内分离到的固氮根瘤菌Frankia属细菌，宿主植物主要有四川桤木(Alnuscermastogyne)、木麻黄(Casuarinasp)、沙棘(Hippophaesp.)、赤场(Alnussp.)、杨梅(Myricasp.)和胡颓子(Elaeagnussp.)等。此外还有百合科(Liliaceae)百合(Liliumsp.)细胞中的内生菌研究。篇名中第一次出现内生细菌的原著论文是1996年中国农业大学刘云霞等关于水稻内生细菌巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)在水稻内分布的研究[5]，以及吴加志等关于Enterobacter，Pseudomonas和Bacillus三属植物内生细菌在植物病害生物防治潜力方面的研究[6]。受国外植物内生细菌研究的影响，作为植物病害的生防因子，我国棉花、水稻、马铃薯等作物的内生细菌首先受到了关注。我国首次正面研究内生真菌的是已故南京农业大学终身教授李扬汉关于麦田有毒杂草毒麦(Loliumtemulentum)中的内生真菌的观察[4]，此后我国内生真菌的研究沉寂了约10年。邱德有等关于红豆杉内生真菌的先驱性研究开启我国药用植物内生真菌研究的火热时代[3,7-9]。目前，关于药物开发指向的植物内生微生物及其所产生理活性物质研究，在我国遍及以药用植物和农用植物为主的数十科野生植物和农作物，连年产出百余篇原著论文和十余篇文献综述(图1)。按现在的趋势，我国年度发表植物内生真菌相关原著论文将很快会超过两百，研究的热潮有增无减，成为植物内生微生物研究中最活跃的领域。植物内生真菌的另一个重要内容——禾本科植物麦角类内生真菌的研究则到甘肃草原生态研究所南志标从新西兰留学回来后才真正兴起。南志标先生回国后在甘肃省自然科学基金和国家人事部归国留学人员科研启动资金的资助下，利用执行联合国粮食计划署2817项目咨询任务时从新疆阿勒泰地区采集到的野生植物样品，首次检测到我国产布顿大麦草(Hordeumbugdanii)中含有内生真菌，并指出了内生真菌的植株能促使宿主植物总生物量、干物质产量、根重以及分蘖数均有所增加。同时也发现，甘肃省的中华羊茅、紫羊茅和部分雀麦属植物中不同程度的含有内生菌[10-11]。同时，在美国牧草种子公司的资助下，新疆草原研究所的李宝军等利用新疆种质资源库的11种牧草种子进行了内生真菌的检测，发现醉马草种子中含有内生真菌[12]。进入21世纪后，关于禾本科植物内生菌的研究有兰州大学的南志标/李春杰课题组、南开大学的高玉葆/任安芝课题组以及南京农业大学的王志伟/纪燕玲课题组等开展持续性的研究。

2植物内生微生物研究的基本特点

首先应该指出，国际国内植物内生微生物研究最大的特点是其范围之大、涉及微生物的种类之多样、功能之繁杂、潜力之广阔。据现行学术界通用的概念和范畴，只要是有机会在植物体内出现的微生物，几乎无所不包含在植物内生微生物的范畴之内[13-15]。这个特征决定了植物内生微生物的研究领域是广阔的，所涉及的学科除生物科学类各基础学科外，还有农学和林学类各基础学科、药物化学、医学、生物工程、食品保藏与加工等多方面的学科。因此，植物内生微生物的研究适合多领域共同协作，在视角和概念运用等方面出现多元化也是很自然的。第二，植物内生微生物基本功能是多层次的。最基本的层次是微生物本身的显。这种功能以微生物的分离物为基础、在人工培养时即得以表达，可通过人工培养以及人工发酵进行研究、挖掘和改良，我国这方面的研究报告最多[16-18]。第二层次是微生物和宿主植物形成共生体(Symbiota)所表现出来的功能。就像绝大多数产毒素的冷季型禾本科植物与其Epichloae类内生真菌的共生体那样，这种毒素的生产和积累的功能不是植物或微生物单独所具有的，或者单独能达到的强度和高度，只有通过宿主植物和内生微生物形成共生体后才体现出来[19-21]。第三层次是内生微生物/宿主植物共生体在不同环境中所表达出来的不同功能或不同程度。上述产毒Epichloae类内生真菌和其宿主植物的共生体也不是在任何时候、任何环境中都能生产和积累毒素，在某种特定的环境条件下生产毒素(多)，在另外的条件下则少生产或根本不生产毒素[19,22]。植物生长环境直接介入微生物和宿主植物共生体的生物学特性的表达。这一现象十分符合植物和微生物相互作用的基本规律，可能对利用植物内生微生物的生理活性物质进行生物制药研究和开发的科研人员也会有积极的启发。第三，植物内生微生物给人类带来的影响不全是有益的，有时也会出现有害的一面。从文献的描述来看，这一点在我国目前仅在少数研究中引起了注意。黑麦草内生真菌、苇状羊茅内生真菌、疯草内生真菌等该宿主植物带来的毒素生产和积累则是最突出的例子。无论是产毒的禾本科植物内生真菌还是疯草内生真菌，已经被人们发现的这些有害事例已经给社会造成了巨大的损失[19,23]。另外，虽然没有出现鹅观草致毒的报道，但从其中的内生真菌中也检测到了一些毒素生产基因(王志伟等，未发表)。因此，我们有必要对植物内生微生物给人类带来有害影响也给以足够的关注。同样，我们固然可以期望植物内生微生物给宿主植物带来或加强抗菌作用(Antagonism)、化感作用(Allelopathy)等抑制其它生物生长和发育的功能，在植物抗病、抑制杂草等方面起到一定的正面作用。但另一方面，这些作用是否会导致区域内生物多样性的降低[24-25]，产生新的生态问题？这些都需要今后去认真评价。第四，植物内生微生物的功能一部分可通过生物学/生物化学的特征表现出来，另有一部分功能必须通过生态学的方法才能加以研究和利用。新西兰在飞机场及其周边大规模种植产毒素Epichloae类内生真菌和其宿主植物共生体，以此驱避在机场聚集的鸟类(JohnCuradus，私人通信)。这是通过生态学的方法对植物内生微生物的功能加以利用的一个代表性事例。在我国，利用植物内生微生物进行植物病虫害的生物防治也是这类事例中的典型[25-27]。在这些情况下，内生微生物和其宿主植物的共生体特征的稳定表达就十分重要。一般来说，植物内生微生物作为药用微生物利用时，微生物本身相对重要一些，而作为农用资源或环境修复手段加以利用时，共生体的特征则往往更加重要。

3我植物内生微生物研究的发展和特点

进入21世纪，特别是近10年来，我国植物内生微生物的研究发展迅猛。据最保守统计，在我国发行杂志上由我国科研人员发表的植物内生微生物的论文(篇名中含有“内生菌”、“内生细菌”或“内生真菌”字样的论文)在2008年以后每年都超过200篇，2013年论文总数已逼近300(图1)。考虑篇名中没有体现出来的论文以及在国外发表的论文，我国科研人员近年来发表的植物内生微生物研究的论文大约每年可达400篇以上。研究领域也全面开花，基本形成了4大板块、24个分支的局面(表1)。至此，我国已形成了一支队伍庞大、成果丰硕的科研力量，在国际植物内生微生物研究中占有十分显要的地位。从整体趋势来看，我国植物内生微生物研究的特点可概括为“四多四少”。资源探索多、分离培养多、活性检测和生物功能研究多，基础性前期工作多；方法研究少、涉及林木少、与宿主的关联少、实际应用少。特别是以药物开发为目的的资源探索性研究报告最多，以抗菌、抗肿瘤等指标为主的药物开发指向的论文大量出现，形成了我国植物内生微生物研究中最耀眼的亮点[17,28-29]。植物内生微生物研究以生理活性检测以及活性物质探索为主要范式(Paradigm)之一，思路清晰易懂、方法简单、实施容易，是研究生训练的好材料。关注我国植物内生微生物论文数量的上升时机，也不难发现其上升趋势和研究生毕业数量的上升基本同步(图1)。从论文数量整体来看，从20世纪末开始我国科研人员在本国的科学杂志上(中国学术期刊网络出版总库收录部分，1979-2013年)，植物内生微生物的研究有了飞速的发展。在21世纪的第一个10年中，我国关于植物内生微生物研究的突飞猛进，论文数量从2000年的14篇增加到2010年的257篇，翻了18.4倍(图1)；研究对象也从Frankia等非共生固氮根瘤菌为主、加上几个关于红豆杉内的紫杉醇生产菌以及冷季型禾本科植物中的麦角菌类真菌等零星报道，发展到包括草本、木本、单子叶、双子叶以及蕨类等数十科近百属植物中的微生物；研究方向也增加到包括医药、农业、环境、食品等多个领域(表1)。最近几年来，植物内生微生物相关的论文数量继续增加、研究范围继续扩大，形成了我国微生物学研究中发展最快、研究人员增长和人才积累最快、研究范围扩大最快的领域。在这个领域中，显示各种生理活性、具有潜在的药物开发价值的植物内生真菌以及它们所生产的生理活性物质不断出现，具有抗病虫害活性的内生微生物菌株也大量积累，新的微生物物种被相继提出，并不断开发出重金属抗性增强、难降解化合物的分解等新的应用功能。同时，通过参与植物内生微生物研究而得到基本科学训练的年轻学者也大量进入社会，我国植物内生微生物的研究蕴含着巨大的发展潜力。但是，我国植物微生物研究发展不平衡。在我国的期刊上发表的研究报告主要集中在医药方向和农业方向，尤其是以生物医药开发为目标的药用植物内生微生物的论文数量尤为突出[17,28-29]。而在大尺度生态学中十分重要的天然林木以及草原野草中的内生微生物则报道相对较少[12,30-33]。在研究程度上也存在着“初步研究多、深入追究少”的特点。在生物活性和活性物质研究方面，分离和初步鉴定多、周密的分类鉴定少，活性菌株的初级筛选多、达到或接近可应用水平的筛选少，活性检测和物质初步提纯多、化合物纯化与鉴定少，发展到后期应用的事例则寥寥无几，有关生理活性物质生产的基因及其调控的研究则更少[17,29]。在生态学研究方面，也存在微生物的群落结构、生态分布、生活史研究、培养条件的优化等都比较少的倾向[33-36]。此外，微生物的分离技术、培养技术、微生物的消除技术、接种技术等开发还相对薄弱。考虑这些内生微生物的农业应用，能将植物内生微生物进行工具化的上述操作技术也有待于今后进一步开发。因此，我国的植物内生微生物研究的质量进一步提高、应用面继续扩大、实用性大幅度增加的空间依然很大。

4我植物内生微生物研究的成

4.1医药指向的研究

1993年，Strobel等发表了关于红豆杉内生真菌合成紫杉醇这一发现，在国际上形成了药用植物内生微生物开发的范式。受此范式影响，我国医药指向的植物内生微生物研究以药用植物为材料居多，尤以红豆杉类植物、红树类植物、鬼臼类植物、石斛等兰科植物以及银杏等植物较为常见。红豆杉属(Taxus)植物主要有短叶红豆杉(Taxusbrevifolia)、红豆杉(T.wallachiana)、南方红豆杉(T.chinensisvar.mairei)、云南红豆杉(T.yunnanensis)、东北红豆杉(T.suspidata)等，我国微生物学工作者从中分离得到了紫杉霉属(Taxomyces)、镰孢霉属(Fusarium)、链格孢属(Alternaria)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)、曲霉属(Aspergillus)等植物内生真菌和内生细菌。从这些微生物中又分别检测到了抗肿瘤、抗氧化、抗动物病原物、抗病原媒介物、抑制特定酶活性等生物活性，分离到了生物碱类、苯丙素、萜类、醌类、脂类、酮类、酚类、有机酸类、甾体类等活性化合物及其衍生物，其中关于紫杉醇生产的研究报告最多[17,28-29,37-38]。常用的红树类植物主要包括生长在包括港澳地区在内的华南沿海的红海榄(Rhizophorastylosa)、秋茄(Kandeliacandel)、木榄(Bruguieragymnorrhiza)、桐花树(Aegicerascorniculatum)、白骨壤(Auicenniamarina)、海漆(Excoecariaagallocha)等。我国微生物学工作者从中分离得到了链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、芽枝霉属(Cladosporium)、镰孢霉属(Fusarium)、拟青霉属(Paecelomyces)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)、青霉(Penicillium)、茎点霉(Phoma)、叶点霉(Phyllosticta)、木霉(Trichoderma)、芽孢杆菌属(Bacillus)等植物内生真菌和内生细菌[39-41]。从这些微生物中又分别检测到了抗菌、抗肿瘤、抗氧化等活性，分离到了肽类、多糖类、尿囊素、异香豆素等活性化合物[37,40-42]。小柴科的桃儿七(Sinopodophyllumhexandrum)、八角莲(Dysasmaversipellis)、南方山荷叶(Diphylleiasinensia)等鬼臼类(Podophylloideae)植物内生微生物中有些菌株能合成具有抗肿瘤活性的鬼臼毒素(Podophyllotoxin)；银杏(Ginkgobiloba)的内生微生物中有些具有明显的抗氧化作用；夹竹桃科的长春花(Catharanthusroseus)的内生微生物中，镰孢霉属(Fusarium)真菌等有些能合成具有明显的抗癌作用的长春新碱(Vincristine)；天麻(Gastrodiaelata)、石斛类植物(Dendrobiumspp.)等兰科(Orchidaceae)植物中的密环菌属(Armillaria)、角担菌属(Ceratobasidium)、皮伞菌属(Marasmius)、镰孢霉属(Fusarium)、丝核菌属(Rhizoctonia)等内生真菌也生产多种生理活性物质，获得了高度的关注[17,29,37]。关于药用植物的内生微生物及其药物指向的生理活性物质的研究在我国如火如荼，从各个角度总结出来的综述也层出不穷[9,37,43-44]，在此不一一赘述。但是王剑文，谭仁祥等提出的利用内生菌寡糖诱导黄花蒿(Artemisiaannua)发根(Hairyroot)合成青蒿素(Artemisinin)的研究提示了植物内生微生物利用的一个新方向[45]，提示了植物内生微生物的作用并非一定要以微生物为主的思路，唤起我们对内生菌和宿主两者的相互作用的关注，值得借鉴。

4.2涉农的植物内生微生物研究

涉农的植物内生微生物研究在我国以农作物以及部分药用植物为材料的居多，包括醉马草、羽茅、鹅观草等冷季型禾草，水稻、小麦、玉米等重要粮食作物，番茄、油菜、棉花、辣椒、香蕉、哈密瓜等，其中重要经济作物体内的内生微生物是关注的焦点。对这些重要农作物体内微生物研究的主要指向为植物病害的生物控制、植物生长发育的促进和抗逆性的提高[26,46-49]，此外也兼顾了一些为生物制药服务的药物筛选等目的。有些植物内生微生物能产生植物激素、抗菌物质、杀虫物质、昆虫拒食物质等[19,25,50]，更多的生理活性和抗病虫害功能的机理尚不清楚[24,27,51-53]。涉农的植物内生微生物研究还可为植物育种服务。冷季型禾本科植物的麦角菌类内生真菌(Clavicipitaleangrassendophytes)大部依赖于活体植物生存，并随宿主植物种子进行垂直传播，因此可作为育种手段加以应用[21,54]。十多年来，南开大学高玉葆/任安芝课题组以多年生黑麦草、羽茅等植物为材料研究了内生真菌对宿主植物抗旱、耐盐碱、重金属抗性等性能的影响，提示了内生真菌在提高宿主植物抗逆性方面的潜力[55-57]。近年来，还有两类农业指向的植物内生微生物值得关注。

作者：王志伟 陈永敢 王庆璨 纪燕玲 单位：南京农业大学 海南丰源无公害农业技术研究所