神经节苷脂GM1与亚低温联合应用对新生鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用

作者：王海英, 刘家浩, 柴斌英, 唐洪丽

【关键词】 神经节苷脂GM1；亚低温；脑缺氧；缺氧缺血性脑损伤；大鼠[中图分类号]R363,,,,

[摘要]目的 探讨神经节苷脂GM1与亚低温对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用。方法 用75只新生7d的SD大鼠制作缺氧缺血（HIBD）模型，随机分为假手术（A）组、模型（B）组、神经节苷脂GM1（C）组、亚低温（D）组、神经节苷脂与亚低温联合干预（E）组共5组，每组15只。观察不同干预方法对新生大鼠缺氧缺血后24h脑含水量、神经细胞死亡率及30d后学习和记忆能力的影响。结果 B组脑含水量、神经细胞死亡率显著高于A组，学习、记忆能力显著下降(P<0.05)，各干预组脑含水量、神经细胞死亡率下降，学习、记忆能力显著改善（P<0.05），而以E组改变更明显(P<0.05)。 结论 神经节苷脂GM1和(或)亚低温均可显著减轻HI后脑损伤，联合干预保护作用更佳。

[关键词]神经节苷脂GM1；亚低温；脑缺氧；缺氧缺血性脑损伤；大鼠[中图分类号]R363

Neuroprotective effects of ganglioside GM1 and mild hypothermia on hypoxicischemic brain damage in neonatal rats

Abstract: Objective To investigate the protective effects of ganglioside GM1 and/or mild hypothermia on hypoxicischemic brain damage in neonatal rats. Methods Seventyfive neonate rats(subjected to unilateral left carotid artery ligation and given 8%oxygen for 2h) were randomly allocated to five groups：sham operation group(A),model group(B),GM1 group(C),hypothermia group(D), GM1 and hypothermia group(E).Changes of brain edema and percentage of dead neurons(HDNP) at 24h and behaviors of learning and memory at 30d after HI insult were investigated. Results Brain edema and HDNP were significantly increased in group B compared with group A,whereas behaviors of learning and memory in group B were reduced significantly. Brain edema,HDNP and behaviors were improved in group C,D and E(P<0.05)，the most obvious changes was observed in group E(P<0.05). Conclusion Ganglioside GM1 and/or mild hypothermia have protective effects on HIBD,especially when ganglioside GM1 and mild hypothermia are used simultaneously.

Key words: ganglioside GM1; hypothermia; brain hypoxia; hypoxic ischemia encephalopathy; rats　(Modern Medical Journal,2007,35: 1720)

新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic ischemic encephalopathy,HIE）是指围生期窒息缺氧所导致的脑缺氧缺血性损害而出现的一系列临床脑病表现，是新生儿时期危害最大的常见病之一，常可引起不可逆的组织损伤，从而引起一系列神经系统后遗症。目前许多保护胎儿和新生儿免于缺氧缺血性脑损伤（HIBD）的药物或非药物的干预方法取得了长足的进步，但迄今尚无统一有效的治疗方案。近年来随着对HIE发病机制研究的不断深入，更多的研究焦点集中在寻找一些新的有效治疗措施，以期完善今后的临床治疗方案。神经节苷脂是神经细胞膜的组成成分，对神经细胞的发育和再生起重要作用，对脑缺血、脑损伤具有明显的保护作用。亚低温对HIBD亦有肯定的保护作用，改善近期和远期预后，不良反应少。本实验采用亚低温与腹腔注射神经节苷脂GM1联合治疗新生大鼠HIBD，观察其治疗效果。

1 材料与方法

1.1 动物与分组75只新生7d SD大鼠，由东南大学实验动物中心提供，雌雄不限，体重12～16g，随机分为5组，即假手术（A）组、模型（B）组、GM1（C）组、亚低温（D）组、GM1 与亚低温联合干预（E）组，每组15只。

1.2 模型制作参照文献[1]制备HIBD动物模型。乙醚吸入麻醉后取颈部正中切口，分离左颈总动脉并永久性结扎（5/0丝线双结扎），缝合切口，术后将幼鼠返回母鼠笼中，恢复2h后进行低氧处理：将鼠放入37℃缺氧盒中，以1.5L・min-1的速度通入8％氧氮混合气体2h。A组只分离左侧颈总动脉但不结扎，缝合皮肤后亦不作缺氧处理。

1.3 干预方法C组与E组于缺血前及缺氧后即时腹腔注射神经节苷脂GM1（商品名 施捷因，生产批号20066，阿根廷TRB制药厂生产）30mg・kg-1；D组与E组于缺氧结束后立即放入半导体可调恒温水浴箱的玻璃缸内，水温29℃，肛温维持在32℃，持续24h；B组与C组同时放入37℃水浴箱中的玻璃缸至治疗结束。使用半导体温度测定仪测定直肠温度（TR），亚低温期间采用秦梅等[2]配方奶，以细孔玻璃滴管喂养，每2h喂养1次。

1.4 标本处理与观察项目

1.4.1 脑含水量测定 新生大鼠于缺氧缺血（HI）后24h断头处死，分离左右大脑半球，用1/万电子天平分别精确称重并记录，然后置于烤箱中100℃烘烤5h，再称取脑的干重，按公式：脑含水百分比=[(湿重-干重)/湿重]×100%计算脑含水百分比。

1.4.2 神经细胞死亡率 HI后24h将鼠断头取脑，4％多聚甲醛溶液固定后，沿丘脑中1/3平面行冠状位切块，常规石蜡包埋、切片，片厚5μm，行HE染色，每张切片在结扎侧的皮质、海马取3个不同视野（×400），计算每视野的存活细胞数和神经细胞死亡率。神经细胞死亡率＝（A组细胞数-模型组或干预组存活细胞数）/A组细胞数×100％。

1.4.3 学习和记忆能力测定 大鼠于HI后30d做三臂迷宫实验，连续10次测试中有9次正确反应即为达到学会的标准,记录动物达到标准所需的次数,以此作为学习快慢程度的指标。24h后重复以上实验过程,记录20次，观察大鼠的记忆能力，计算百分率。

1.4.4 统计学处理 所有数据结果均以 ±s表示，采用SPSS11.5统计软件处理数据，两组比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有显著性意义。

2 结 果

2.1 动物行为观察 A组动物肢体活动自如；B组15只鼠恢复自然通气后均见自发向左侧旋转爬行；而各干预组仅3只出现旋转爬行。

2.2 大体标本观察 A组新生鼠无脑膜血管扩张，无脑组织肿胀及出血；B组左侧脑膜血管扩张和组织水肿明显，颜色苍白；各干预组脑组织未见明显肿胀。

2.3 脑含水量变化 B组左脑含水量明显增加，与右脑、A组及干预各组比较差异均显著(P<0.05)；E组与C、D组相比，脑含水量减少(P<0.05), C组与D组之间无明显差异(表1)。

表1 各组HI后24h左、右脑含水量比较（略）

2.4 组织病理学变化 A组右侧脑组织细胞排列规则，细胞结构及层次清楚，未见水肿及神经元变性坏死，B组缺血侧大脑皮层、海马细胞排列紊乱，出现空泡、变性和坏死，神经元细胞数减少，干预各组大脑皮层、海马细胞变性、坏死明显减少，神经细胞死亡率较B组明显降低(P<0.05)(表2、图1~4)。

表2 各组HI后24h大脑皮层、海马神经细胞死亡率比较（略）

2.5 对学习和记忆能力的影响 B组与A组比较学习及记忆能力下降，C、D、E组学习及记忆能力明显改善，E组改善最明显(表3)。

表3 各组HI后30d学习、记忆能力比较（略）

图1 － 图4 略

3 讨 论

新生儿HIBD是指新生儿在围生期缺氧窒息导致脑的缺氧缺血性损害，其特征性的神经病理及病理生理改变为脑水肿、神经元变性坏死、出血等。缺氧引起脑血管自主调节功能障碍、能量代谢障碍、乳酸堆积、线粒体功能受损、氧自由基增加、钙超载、兴奋性氨基酸过度释放等，在临床上引起一系列脑病表现，不仅致残率高，发病率、死亡率均较高。HIBD在围生期神经系统疾病中占有重要地位，目前对其发病机制及治疗措施的研究一直是儿科研究人员关注的热点。本实验中，我们通过结扎新生大鼠一侧颈总动脉，置于8％氧氮混和气的低氧环境中，观察到新生大鼠在HI后短期内向左侧旋转爬行，结合早期脑水肿和皮层组织病理学变化，提示新生大鼠HIBD动物模型已成功建立。神经节苷脂对神经保护作用近几年受到很大关注，广泛应用于缺血性神经系统疾病，外源性神经节苷脂可以穿透血脑屏障，大量的动物及临床实验均证明缺血后立即给予神经节苷脂GM1，可以稳定细胞膜，明显改善神经功能，缩短HIBD病程，有效逆转其病理过程，阻断继发性脑损伤的发生发展，促进受损脑功能的恢复，对改善临床症状、缩短病程、提高治愈率、降低致残率和致死率有积极意义。本实验在缺血前及缺血缺氧后2次腹腔注射神经节苷脂GM1，结果表明可明显减轻脑水肿，降低神经细胞死亡率，对新生鼠HIBD具有明显的神经保护作用。亚低温(32～35℃)对HIBD有肯定的保护作用[3]，在缺氧缺血甚至在再灌注数小时采用全身性或选择性头部亚低温都可获得不同程度的持久保护作用，改善近期和远期预后。动物实验证实在HIBD后6h内降低脑温2～6℃并维持3～72h，脑损伤程度可减少25％～80％。临床上在患儿出生或缺氧缺血发生后6h内实施亚低温24～72h可以降低中重度脑病患儿的伤残率和死亡率[4], 生后5~7d患儿的头颅CT扫描显示中重度缺氧改变的发生率明显降低，并且生后7~10d的新生儿行为神经测定评分(NBNA)也获明显改善[5]。低温的保护机制可能包括降低氧耗、维持正常脑血流和细胞能量代谢、减少乳酸堆积、减轻脑水肿等。最近有学者认为亚低温的保护作用或许与降低铁介导的神经毒性有关[6]。亚低温的保护作用与低温的深度及治疗时机、持续时间密切相关，动物实验及临床研究均提示在HI发生后6h内实施亚低温治疗疗效显著。Maier等[7]研究发现轻度低温（33℃）组无呼吸频率下降、心律不齐等系统并发症，麻醉后恢复时间短，认为轻度较中重度低温（<30℃）安全且易控制。低温持续72h与持续24h相比，脑保护作用明显增强，但动物耐受率降低，副作用较多[8]。亦有多中心、随机、前瞻控制临床试验报告指出在出生或HI后6h内实施适度的(33℃)全身性亚低温48h亦可产生不同程度的副作用，包括血小板计数降低、凝血酶原时间延长、心率减慢、升压药物使用时间延长及抽搐发作次数增加等[9]，故亚低温的临床应用仍待进一步研究。本实验采用HI后即刻实施32℃的轻度低温并持续24h，研究结果显示具有明显的近期及远期保护作用。缺血后神经元损伤是由多种因素共同参与的复杂过程，故治疗上应联合阻断不同的损伤机制以达到较为满意的治疗效果。为了进一步提高HIBD治疗效果，本实验尝试在急性期应用神经节苷脂GM1的基础上，辅以适当亚低温治疗，结果表明联合干预后保护作用更佳，为临床新生儿HIBD提供了可能的治疗途径。

[参考文献]

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[7]Maier C M, Ahern K, Cheng M L, et al. Optimal depth and duration of mild hypothermia in a focal model of transient cerebral ischemia: effects on neurologic outcome, infarct size, apoptosis, and inflammation[J].Stroke, 1998,29(10):21712180.

[8]秦梅，王兴河，陈莲,等.亚低温对缺氧缺血损伤保护作用的实验研究[J].中华围产医学杂志，1998，36：105108.

[9]Eicher D J,Wagner C L,Katikaneni L P.Moderate hypothermia in neonatal encephalopathy:safety outcomes [J].Pediatr Neurol,2005,32(1):1824.