生物型人工皮肤及复合bFGF对兔创面愈合的影响

[摘要]目的:探讨生物型人工皮肤复合碱性成纤维生长因子对兔创面愈合的影响。 方法:以动物膜组织为基材,经环氧交联固定及表面透明质酸修饰制备生物型人工皮肤,复合碱性成纤维生长因子形成生物活性人工皮肤。光镜观察生物型人工皮肤的结构,进行物理及生物性能测定水蒸汽透过量、液体吸收量、力学性能及细胞毒性。最后将两种人工皮肤植入兔全层皮肤创伤模型,观察术后4周内创面愈合情况,进行病理组织学检查评估创面的修复质量。结果:光镜下生物型人工皮肤为无细胞的胶原结构。贴附性好,无免疫排斥反应,有一定韧性,水蒸汽透过量:372±45g/(m2×24h),液体吸收量:269±38%,无细胞毒性。复合少量碱性成纤维生长因子后,明显促进创面愈合,减少瘢痕形成。结论:生物型人工皮肤复合少量碱性成纤维生长因子使创面快速愈合,可作为烧伤科、整形外科进行皮肤重建的良好替代物。

[关键词]环氧交联固定;生物型人工皮肤;bFGF;创面愈合

[中图分类号]R332 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2010)10-1493-04

Effect of biological artificial skin combine basic fibroblast growth factor on rabbit's wound healing

HUANG Jian-yan,ZHONG Xing-xia,ZHAO Neng-yu,XU Bin,Xu Guo-feng

(Tube & Membrane Centre,Grandhope Biotech Co.,Ltd.National Engineering Laboratory for Regenerative Medical Implantable Devices,Guangzhou 510663,Guangdong,China)

Abstract:ObjectiveTo study the effect of biological artificial skin combine basic fibroblast growth factor on rabbit's wound healing. Methods The biological skin was prepared by porcine membrane with epoxy cross-linking fixation and surface hyaluronan treatment,and then combined with basic fibroblast growth factor to develop into bioactive artificial skin. Histological observation was conducted,and physical and biological assessments were carried out to detect the moisture vapor transmission rate,liquid absorbability mechanical test and cytotoxicity. The effect of both artificial skins was evaluated by the rabbit's full-thick wound model. The rates of wound healing and pathologic change were observed within 4 weeks postoperation.Results Histological observation showed that biological artificial skin consisted primarily of collagen without cell fragments. It tightly covered on the wounds with good histocompatibility,372±45g/(m2×24h) moisture vapor transmission rate, 269±38% liquid absorbability. When combined with basic fibroblast growth factor,it can significantly accelerate the healing of rabbit wound with fewer scars.ConclusionThe biological artificial skin combine basic fibroblast growth factor can significantly accelerate wound healing,and it would be a promising substitute for the skin reconstruction in department of burn and plastic surgery.

Key words: epoxy cross-linking fixation; biological artificial skin; bFGF; wound healing

早期削痂,及时封闭创面是提高大面积深度烧伤患者成活率最关键、最有效的措施之一[1]。但是,迄今为止,尚无一种理想的皮肤替代物。瘢痕增生、挛缩、痛痒、无汗、功能障碍等仍然是大面积深度烧伤削痂创面覆盖物残留的主要问题,始终困扰着患者和临床医生。因此,建立一种理想的皮肤替代物,无论是对急性烧伤病人,还是伤后要求皮肤修复重建的病人都有重大作用。

以天然生物材料制造人工皮肤是皮肤替代物研究的发展趋势[2]。我们以健康猪的膜材,经公司专利技术、环氧固定及病毒灭活等系列的生化处理(专利US6106555,中国专利998144433)制备成生物型人工皮肤,再复合不同质量的碱性成纤维生长因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF),以期望获得一种理想的皮肤替代物。植入兔全层创伤模型,通过观察创面愈合情况及病理形态学观察,了解其对皮肤缺损的创面愈合的影响。

1材料和方法

1.1 材料:健康猪的内脏膜材由广州市良种猪场提供。实验动物为5只雄性新西兰大白兔,体重2～3kg,由广州市穗北实验动物中心提供。bFGF冻干粉(活性单位1×106IU/mg)由于暨南大学生物医药中心赠送。

1.2 生物型人工皮肤与生物活性人工皮肤的制备:新鲜的健康猪腹膜,刮净修饰,用1‰新洁尔灭溶液4℃浸泡过夜。70%乙醇浸泡1 h,30%乙醇浸泡过夜。用纯水反复漂洗去除乙醇,再浸泡于4℃纯水至少1h使膜组织中细胞膨胀,然后超声处理以脱细胞。再用0.1M的聚环氧丙烷加入NaOH使pH8.5～10.5,室温下交联膜组织1周,每2～3天换液一次,使组织充分交联。PBS液充分漂洗以去除残留的聚环氧丙烷。将膜组织剪裁成2.5cm×2.5cm大小,表面涂布1%透明质酸钠,包装后以Co60照射消毒即制得生物型人工皮肤。

如表面涂布1%透明质酸,再加入不同质量的bFGF,包装后以Co60照射消毒即制得生物活性人工皮肤。

1.3形态学观察:取制备的生物型人工皮肤,常规石蜡包埋后,4μm厚切片,进行HE染色,光镜下观察。

1.4 水蒸汽透过量试验:按GB/T 12704-91规定的方法进行。采用透湿杯法,试验箱温度控制精度为±0.5℃,相对湿度控制精度为±2%,循环气流速度为0.3～0.5m/s。

1.5 液体吸收量:按YY/T 0472.1-2004中附录C规定的方法时行。试验条件:温度21℃±2℃,湿度60%±15%。

1.6 力学性能测定:将样品置于RGM-3010型微控电子式拉力试验机做拉伸试验,牵引速度为15mm/min,定应力2MPa,温度25℃,湿度65%。

1.7 细胞毒性实验

1.7.1 浸提液的制备:浸提液介质为生理盐水,按样品质量与浸提液体积比0.2g/ml,在37℃无菌条件下浸提72h,作为材料浸提液。

1.7.2 细胞培养及分组:采用96孔培养板,各组加入5×103/ml L929小鼠成纤维细胞悬液200μl,37℃、5% CO2培养箱孵育。待细胞贴壁后,分别按照以下分组定期更换培养液(100μl/次):①阴性对照组(n=8),10% FBS+DMEM细胞培养液;②实验1组(n=8),50%材料浸提液;③实验2组(n=8),100%材料浸提液;④阳性对照组(n=8),含0.64%苯酚的10% FBS+DMEM细胞培养液。

1.7.3 MTT法检测细胞活性:分别于培养24h、48h和72h,按照20μl/孔、加入5mg/ml MTT,37℃、5% CO2下培养4 h;吸出培养液,再加入DMSO 150μl/孔,室温下振荡于结晶物溶解,BIO-RAD Mode680酶标仪波长570nm测定OD值,计算细胞增殖率(RGR)=实验组OD值/阴性对照组OD值×100%。细胞毒性判断标准:0级为≥100%,1级为75%～99%,2级为50%～74%,3级为25～49%,4级为1～24%,5级为0。

1.8 动物实验

1.8.1实验分组:①A组:自然愈合组;②B组:生物型人工皮肤组;③C组:生物活性人工皮肤(含20μg bFGF);④D组:生物活性人工皮肤(含100μg bFGF)。

1.8.2手术过程:兔背部皮肤备皮,全麻成功后,常规消毒铺币,在兔背部皮肤创造4个直径2cm×2cm大小全层皮肤伤口,A、B、C、D组各占一个伤口。其中B、C、D组用丝线将人工皮肤间断缝合在伤口周皮肤上(见图1)。以油纱覆盖伤口,包扎固定,术毕。

1.8.3术后观察:术后第3天、1周、2周、3周、4周定期观察伤口情况,仔细测量伤口大小。术后1周拆线,术后4周将兔处死,取伤口及愈合组织作病理组织学检查。

1.9 统计学分析:伤口收缩率各组间进行t检验,P

2结果

2.1 生物型人工皮肤的外观及形态学观察:生物型人工皮肤外表洁净、柔软,淡黄色,表面平整,有“毛面”和“光面”。HE染色光镜下见膜片由排列有序的胶原纤维组成,无细胞成分存在(图2)。

2.2 水蒸汽透过量试验:按标准规定应不低于300g/(m2×24h),测试结果为372±45g/(m2×24h),均符合标准要求。

2.3 液体吸收量:按标准规定应不低于200%,测试结果为269±38%,均符合标准要求。

2.4 力学性能测定:最大负荷12.82±2.77N(N=8),抗拉强度1.94±0.42MPa(N=8)。表示材料有一定的韧性。

2.5 细胞毒性实验:在细胞培养24h、48h、72h的不同时期用倒置显微镜观察,除阳性对照组细胞数量明显减少、细胞固缩甚至崩解外,两实验组与阴性对照组相似,细胞数量明显增加,生长良好。所测OD值见表1,据此计算RGR。实验组RGR在24h、48h、72h均大于90%,而阳性对照组的最大RGR在培养48h时出现,为53%。根据规定,异种材料细胞毒性分级在0～1级,无细胞毒性,可用作生物材料。

2.6 动物实验

2.6.1大体观:术后各组创面逐渐愈合,整个观察过程无伤口感染,无动物死亡现象。术后1周,各组皮肤伤口干洁,A组伤口油纱紧贴,B、C、D组伤口人工皮肤紧贴(图3);术后2周,各组创面缩小,A组伤口油纱脱落,B、C、D组伤口人工皮肤仍紧贴;术后3周,各组皮肤伤口明显缩小,表皮再生,表面有大小不等的血痂,B、C、D组伤口人工皮肤已脱落;术后4周,各组皮肤伤口愈合,各别的还有痂未完全脱落(图4)。

伤口原始大小为4cm2,测量各组皮肤伤口收缩率如图5所示,术后3天及1周时,含bFGF的C和D组,伤口收缩较快。术后3周,B、C、D组伤口收缩明显变小,与A组的差异有统计学意义(P

2.6.2组织学分析:术后4周,各组皮肤组织中央为瘢痕组织,表面的上皮完全再生,呈鳞状增厚,周边组织呈完全再生,表皮及附属结构完整。其中以A组的瘢痕区域最大,C组的瘢痕区域最小。D组的皮肤组织血管周围水肿,有炎性细胞浸润,瘢痕老化。

3讨论

近年各种皮肤替代物在临床上得到广泛的应用,在提高大面积深度烧伤治愈率及后遗畸形矫正等方面做出了突出贡献[3-5]。目前而言,异体皮是一种最理想的皮肤替代物,但却存在几方面不容忽视的缺点:首先是来源受限,其次是具有传播肝炎病毒、HIV的可能,再次是存在排斥问题。另一种临床上应用较为广泛的异种(猪)脱细胞真皮基质同样也存在植入后两周排斥的问题,并且猪皮质地较硬,在创面的贴附性欠佳[6-7]。

理想的皮肤替代物应具有下有特性:耐用;无抗原性;贴附性好,适合于不规则伤口表面;弹性好;保水性好;防止细菌入侵;促进愈合[8-9]。

本实验中,我们采用高反应活性环氧化物交联处理动物的膜组织,反应条件温和,聚环氧丙烷可以蛋白质分子形成稳定的交联键,大大提高材料的稳定性,并且由于水溶性好使其容易从样品中清除,无残留毒性。而传统的戊二醛固定动物组织技术会遗留细胞毒性的问题[10],相比之下,环氧固定技术明显优越。

透明质酸本身是人体皮肤的构成之一,是人体内分布最广的一种酸性黏多糖,存在于结缔组织的基质中,具有良好的保湿作用,也是皮肤无瘢痕愈合的成分之一。文献表明其在中性环境下带负电荷[11],应用该特性,将其复合带正电荷的bFGF,可以保护bFGF的生物活性。

本实验结果表明,生物型人工皮肤的HE染色光镜下为红染胶原组织,无细胞成分,证明材料脱细胞完全。水蒸汽透过量、液体吸收量均达标准要求,力学测试结果也表明材料有一定的韧性,并且无细胞毒性,证明该技术处理的异种材料达到临床使用的要求。在兔全层皮肤创伤模型中,生物型人工皮肤在兔的创面不产生免疫排斥或炎症反应,可以有效地保护创面,与创面紧密粘合,促进上皮细胞的生长,缩短创面愈合时间,减少瘢痕形成,待创面愈合后人工皮肤干结自然脱落。加入bFGF,在伤口愈合的早期,可以使伤口较快的收缩及上皮化。但大量的bFGF,产生炎症趋化作用,使血管周围的炎症反应增加,瘢痕老化。本实验中,含少量bFGF的生物活性人工皮肤(含20μg bFGF),可以使创面快速愈合,再生的皮肤瘢痕组织少。

由以上实验结果我们可得出,生物型人工皮肤在临床应用中在以下几方面将获得良好的效果:①应用其良好的透汽性和保水性,早期用生物型人工皮肤覆盖创面,减少机体水分丢失,医生可专注于救生命;②质地柔软,一侧“毛面”使其具有良好的贴附性,可使人工皮肤在胸部(因呼吸运动)、关节(弯曲、不规则、活动)等不易固定的部位仍能与创面贴附紧密,应用范围广;③无免疫排斥性,可以减少由排斥反应所造成的二次创伤;④复合少量的bFGF的生物活性人工皮肤,应用于皮肤慢性溃疡、深度烧伤或者各种原因造成的皮肤缺损时,缩短创面愈合时间,减少瘢痕形成,待创面愈合后人工皮肤干结自然脱落,不产生“占位”现象。以上均显示了该型人工皮肤明显优越于现在临床上广泛应用的异种或异体皮脱细胞基质。

综上所述,采用高反应活性环氧化物交联处理动物的膜组织,透明质酸进行表面修饰,形成一种组成和结构与人的皮肤相似的新型人工皮肤。本研制的生物活性人工皮肤柔软性好,耐用,一次覆盖能达到完全愈合。展示了其良好的应用前景,可作为烧伤科、整形外科进行皮肤重建的良好替代物。

[参考文献]

[1]柴家科,盛志勇. 进一步重视大面积深度烧伤皮肤替代物的研究[J]. 中华烧伤杂志, 2002,18(2):73-74.

[2]朱蕾,王昆,刘斌,等.护创膜对兔创面愈合的影响[J]. 解剖学研究,2008(30):365-368.

[3]李智,张宝林,贾赤宇. 脱细胞异体真皮与自体微粒皮复合移植治疗深度烧伤愈合后皮肤质量观察[J]. 中国美容医学, 2009,18 (6) :817-819.

[4]孙维国,樊星. 脱细胞异体真皮修复烧伤瘢痕的临床观察[J]. 中国美容医学,2008,17(7):974-975.

[5]黄智勇,陈大夫,王晓,等. 异体脱细胞真皮基质在烧伤后遗畸形中的应用[J]. 中国美容医学,2006,15(7):773-774.

[6]Sheridan R. Closure of the excised burn wound: autografts,semipermanent skin substitutes,and permanent skin substitutes [J]. Clin Plast Surg,2009,36(4):643-651.

[7]姜笃银,陈壁,徐明达,等. 异种脱细胞真皮基质的制作和临床应用观察[J]. 中华烧伤杂志,2002,18(1):15-18.

[8]Lineen E, Namias N. Biologic dressing in burns [J]. J Craniofac Surg,2008,19(14): 923-928.

[9]Petrulyte S. Advanced textile materials and biopolymers in wound management[J]. Dan Med Bull,2008,55(1):72-77.

[10]袁敬东,李云霞,胡琼华,等. 改良脱细胞异种真皮的制备与动物埋藏实验[J]. 中国美容医学,2006,15(10):1116-1118.

[11]Jederstrom G,Andersson A,Grasjo J,et al. Formulating insulin for oral administration: preparation of hyaluronan-insulin complex [J]. Pharm Res,2004,21(11):2040-2047.

[收稿日期]2010-06-16 [修回日期]2010-09-08