基质金属蛋白酶―2、14及RECK基因在涎腺多形性腺瘤的初发、复发及恶变中的表达及意义

【摘要】目的：研究基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）、基质金属蛋白酶-14 （ma trixmetalloproteinase 14，MMP-14）和RECK基因在涎腺多形性腺瘤（pleomorphic adenoma，PA）初发患者、复发患者及进一步恶变患者组中的表达及其意义。方法：研究对象为新疆医科大学第一附属医院颌面肿瘤外科2004年至2014涎腺PA手术标本50例，其中初发36例，恶变7例，复发7例和10例正常腮腺组织（10例均来自腮腺）。通过免疫组织化学方法检测RECK、MMP-2和MMP-14在各组标本中的表达，并采用半定量方法进行计量。对RECK与MMP-2及MMP-14在各组中的表达采用SPSS 21.0软件包对数据进行统计学分析。结果：MMP-2在正常组与复发组差异有统计学意义（P

【关键词】涎腺；多形性腺瘤；MMP-2；MMP-14；RECK；免疫组化

【中图分类号】R739.8 【文献标志码】A 【文章编号】1008-6455（2015）05-0040-07

多形性腺瘤（pleomorphic adenoma，PA）是涎腺肿瘤中临床常见的，在好发部位中，腮腺不但是其中最丰要，也是最经常见的，复发和有恶变的可能性较大，然而，这个部位发牛、复发和恶变的机理都还缺乏清晰的认识。在恶性肿瘤的侵蚀和转移中，施展重要作用的是基质金属蛋白酶类（Matrixmetalloproteinases，MMPs），在MMPs家族中，MMP-2和MMP-14是较为重要的的成员，它可以通过降解细胞外基质，紧接着破害机体抵抗肿瘤浸润与转移的能力，进而使得肿瘤的浸润性增加。基底膜也起着相同的作用。半胱氨酸丰富蛋白Kazal基元（reversion inducing cysteine rich proteinwith Kazal motifs，RECK）是一种肿瘤抑制基因，是一类抑制剂，起着特殊的抑制基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）活性的作用，可以在转录后水平抑制多种MMPs的表达能力。本实验利用免疫组化方法，通过检测正常腮腺组织、涎腺PA初发患者、复发患者和恶变患者组织中RECK与MMP-14和MMP-2中的表达，对比其表达意义，为临床判别肿瘤的侵袭性和预后提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

材料来源于2014年度新疆医科大学第一附属医院颌面外科腮腺多形性腺瘤（来自腮腺来源）手术切除标本50例，其中包括初发36例，恶变7例，复发7例和10例正常腮腺组织（10例均来自腮腺）本次实验所用标本都未经术前化疗，放疗史的标本组织也经病理证实。研究所用人的离体标本，都通过了新疆医科大学伦理审查委员会审批，50例患者都同意此次实验，还签订了知情同意书。实验中所有标本组织均采用10%福尔马林固定，并用常规石蜡包埋，4um厚度连续切片。

1.2 方法

以PBS代替一抗作为阴性对照，以舌癌组织切片作为阳性对照。采用免疫组化SP染色法对指标的表达进行验证。

1.2.1 试剂：兔抗MMP-14单克隆抗体；兔抗基质金属蛋白酶一2单克隆抗体；鼠抗人RECK单克隆抗体（1：100）； DAB显色试剂盒（上述实验试剂均购自博士德牛物、博奥森及北京中杉金桥牛物技术有限公司）。

1.2.2 设备：37℃恒温孵育箱；4℃冰箱；-20℃冰箱；烘箱；切片机；双目显微镜及BH-2显微照相系统。

1.2.3 实验方法和步骤：①将切好的片子，52℃烘箱中烘烤过夜；②脱蜡、水化：脱蜡前，将片子于室温中放置60min，然后双蒸水洗片子，5min/次，共3次；③去除内源性过氧化物酶，3%双氧水室温孵育lOmin；④双蒸水冲洗片子，PBS将其浸泡5min；⑤0.Olmol/L构橼酸缓冲液（pH=6.1）微波抗原修复lOmin，室温冷却，蒸馏水冲洗，PBS浸泡；⑥37。C孵育片子15min，然后甩于；⑦滴加RECK、MMP-2或MMP-14 -抗稀释液，4℃冰箱过夜，PBS冲洗，3minx3次，每个期以PBS液替代一抗；⑧将牛物素化二抗液滴加于片子上，37℃恒温烘箱孵育25min；⑨用PBS冲洗切片，3minx3次；⑩DAB显色剂显色切片；⑩自来水滴于片子上，用于终止显色；⑿苏木素复染切片5min，双蒸水冲洗切片，盐酸乙酸分化返蓝、脱水；⒀烘干切片，中性树胶封片、显微镜观察目标蛋白的表达。

1.2.4 结果判定：RECK、MMP-14、MMP-2的着色部位在细胞质。400倍镜下观察细胞数，取5个视野数细胞数，并计算阳性细胞与总细胞数的比值。观察过程中，阳性反应是细胞核或细胞浆内出现较为明显的棕黄色或者棕褐色颗粒为准，并且要求背景T净。阳性分级标准：阴性（一）∶

1.2.5 统计学分析：采用Excel输入数据，SPSS21.O统计软件包对结果来进行统计学分析。对于有序的等级资料，采用Ridit分析方法，并将其进行特定的转化，变成连续型资料（R值）：将转换后的数据进行单因素方差分析的F检验，分析正常、初发、复发、恶变四组总体上是否有统计学意义，四组间的两两比较采用LSD检验；当F值无意义时，则不进行组间两两比较。统计水准设定为0.05，P>O.05表明差异无统计学意义。

2 结果

2.1 Ridit分析结果

从表1可知，本实验将实验组分别与标准组（0.5）相比，比较前提是把R均值看成是MMP-2的评价指标，复发组与恶变组的可信区间包含0.5，表明复发组与恶变组的MMP-2表达与标准组无统计学意义。从总体上看，F=3.658，P

2. 2 从表2可以看出，本实验把R均值看作是MMP-14的评价指标，其余几组分别与标准组（0.5）相比较，四组可信区间均包含0.5，表明四组MMP-14表达与标准组均无统计学意义。根据4组比较F=2.205，P=O.098，大于0.05，可以认为MMP-14在四组的阳性表达率差别无统计学意义。

2.3 以R均值作为RECK的评价指标，各组分别与标准组（0.5）相比，正常组与恶变组的可信区间不包含0.5，表明正常组与恶变组的RECK表达与标准组相比，差异有统计学意义。其余2组均无统计学意义。从表3可知，正常组RECK表达最高为0.78，恶变组最低为0.26。根据4组比较F=7.177，P

2.4 相关性分析

由表4、表5可知，Spearman分析结果表明，正常腮腺、涎腺PA初发、复发、恶变组织中，RECK的阳性表达率与MMP-2和MMP-14的阳性表达率均呈负相关（r=-0.887，P

3 讨论

本次研究选取新疆医科大学第一附属医院PA手术患者，总共手机标本50例。涎腺多形性腺瘤初发患者、复发患者、恶变患者的组织都包含在内，实验结果较有代表性和说服力。

统计结果表明MMP-2在正常腮腺组织、PA复发、初发及恶变标本中表达呈区组性，表现为复发和恶变组MMP-2高于正常和初发组。目前认为，MMPs能在肿瘤浸润转移中受到重视，原因是能降解ECM的蛋白成分，破坏肿瘤细胞的侵袭，同时促进肿瘤血管新牛，促进肿瘤的牛长和扩散。本次实验显示，MMP-2蛋白在复发和恶变组的表达明显高于正常和初发组，说明MMP-2参与肿瘤向外浸润、扩展的过程。国外学者在MMP-2在乳腺癌表达时也证明这一观点。

MMP-14属于膜型MMPs。综合最新研究表明其在肿瘤浸润转移的作用丰要表现为：①降解细胞外基质；②激活MMP-2酶源，可以认为是水解的放大作用；③以细胞间粘附分子的桥梁，可以影响细胞的迁徙；④促进血管形成。有学者研究表明MMP-14可以调节VEGF的表达，促进内皮细胞的转移。多种肿瘤组织中均有MMP-14蛋白及mRNA的表达结果呈阳性，说明其表达相对于正常组织是过量的，且其与MMP-2的表达呈协同作用，表明这两种蛋白共同对肿瘤的发牛、发展起着促进作用。本研究中，MMP-14在各组中差异无统计学意义，笔者对这此结果保持审视态度，不对MMP-14的临床检查意义下否定结论，出现此种情况可能与正常组和初发组样本数在总样本数所占比例较高有关。

1998年日本学者Takahashi等发现的一种新的基质金属蛋白酶（MMP）抑制剂--RECK基因。它是由v- Ki- ras基因转染到小鼠的纤维原细胞（NIH/3T3），经过克隆待到。RECK的作用丰要可以归纳为两方面：①抑制肿瘤转移和侵袭；②抑制血管表达。Akira等的研究表明RECK司‘抑制MMP-2和MMP-7介导的纤维结合蛋白的降解。Norihir等在对肺癌患者的研究表明RECK的表达与癌症浸润呈正相关关系，由此可以得出的结论是RECK通过抑制基质金属蛋白酶来使得癌症转移。RECK基因表达抑制血管牛成的研究中，Takeuchi等证实RECK基因能阻碍血管内皮因子的表达，但这种情况只有在内皮血管牛长因子高度表达时才得以体现。本次研究表明RECK在正常组的表达明显高于其他各组，而恶变组的表达低于正常、初发组。在相关关系上，RECK基因表达与MMP-2和MMP-14呈反比，可以推测RECK基因可抑制MMP-2和MMP-14的表达。

综合以上，笔者可以认为，临床上，在涎腺PA恶变，复发组织同时对RECK与MMP-2的进行检测分析其有重要意义，这对于判别肿瘤侵蚀性和预后指标是极有可能。