三种_科鱼类同工酶组织特异性及群体遗传结构分析

摘要采用聚丙烯酰胺垂直板不连续电泳法对3种_科鱼类6种组织（脑、眼、心、肾、肝和肌肉）的9种同工酶（ADH，EST，GDH，LDH，MDH，ME，POD，SDH，SOD）进行分析，结果显示具有明显组织特异性.此外，对每种鱼40个个体的肝脏的8种同工酶进行群体遗传结构分析，共记录15个基因位点，其中呈多态性的位点有 2个（mPod1，sSod1），多态座位比例（P）为0.133，位点平均有效等位基因数（Ae）分别为1.004，0.997和1.015，平均每个位点预期杂合度（He）值分别为0.068，0.066和0.045，平均每个位点实际杂合度（Ho）值分别为0.098，0.083和008.与其他鱼类研究结果相比较，表明3种_科鱼类的遗传多样性居于中等水平.

关键词_科鱼类；同工酶；组织特异性；遗传结构

中图分类号S917.4文献标识码A文章编号10002537（2015）05002708

The TissueSpecificities of Isozymes and the Genetic

Structure in Three Species of Theraponidae

ZHANG Jiandong1，2*， HE Guoqing1， CHEN Gang1，2， TANG Baogui1，2，

PAN Chuanhao1，2， ZHOU Hui1，2， Huang Jiansheng1，2

（1.Fisheries College， Guangdong Ocean University， Zhanjiang 524025， China； 2. Key Laboratory of Aquaculture in South

China Sea for Aquatic Economic Animal， Regular High Education Institute of Guangdong Province， Zhanjiang 524025， China）

AbstractHorizontal starch gel electrophoresis was used to investigate the tissuespecificities of isozymes and the genetic structure of Theraponidae. 9 isozymes （ADH， EST， GDH， LDH， MDH， ME， POD， SDH and SOD） in 6 kinds of tissues （brain， eye， heart， kidney， liver and muscle） of three Theraponidae species were screened and the results showed that the screened isozymes displayed remarkable tissuespecificities. Besides， 8 enzymes from liver tissues in 40 individuals were selected for the genetic analysis. The 8 isozymes systems were encoded by 15 loci， and 2 （mPod1 and sSod1） of them were polymorphic. The proportion of polymorphic loci was 0.133. The average effective numbers of alleles （Ae） were 1.004（at T.jarbua），0.997 （at T.theraps） and1.015（at P.quadrilineatus）， respectively. The mean expected heterozygosities per locus （He） were 0.068， 0.066 and 0.045. The mean actual heterozygosities per locus （Ho） were 0.098，0.083 and 0.08， respectively. This result indicated that there was a middle level of genetic variation in Theraponidae.

Key wordsTheraponidae； Isozyme； tissue specificity； genetic structure

_科鱼类（Theraponidae） 属硬骨鱼纲（Osteichthyes），鲈形目（Perciformes），鲈亚目（Percoidei），为热带区沿岸性鱼类，主要分布于印度西太平洋地区及澳洲、新几内亚、印尼等沿岸海域[1].常见种类有细鳞_（Therapon jarbua）、_（Terapon theraps）、列牙_（Pelates quadrilineatus）和尖吻_（Rhynchopelate oxyrhynchus）4种，在中国发现了4属8种[24]，_科鱼类肉质鲜美香滑，经济价值高，有很大的市场开发潜力[56].

同工酶在生物界广泛存在，变异丰富，且呈共显性遗传，能比较客观地代表基因组的变异，因而能较客观地度量群体的遗传变异大小，且实验条件较为简单，成本较低，结果快速可靠等优点，该技术已成为一种经济有效的群体遗传学研究手段，是近20年来检测遗传多样性研究最普遍的方法[710].本实验研究了3种_科鱼类部分同工酶的组织特异性并探讨其群体生化遗传结构，以期为该物种的种质调查提供有价值的生化遗传参数，同时也为种质资源的合理开发利用和遗传育种等提供部分理论依据.

1材料与方法

1.1试验样本

试验用鱼采自湛江附近海域，通过《中国鱼类系统检索》[11]和世界鱼类信息检索系统（http：//）中的形态学描述确定为_科的细鳞_、_和列牙_，各取5尾，细鳞_平均体长15.45±118 cm，平均体质量52.03±1107 g；_平均体长10.20±0.87 cm，平均体质量14.10±3.98 g；列牙_平均体长1124±1.70 cm，平均体质量20.58±11.30 g.

湖南师范大学自然科学学报第38卷第5期张健东等：三种_科鱼类同工酶组织特异性及群体遗传结构分析活体解剖取其心脏（H）、肝脏（L）、脾脏（S）、肾脏（K）、肌肉（M）、鳃（G）、眼（E）、脑（B）和鳍（F）9种组织或器官，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0，4 ℃预冷）冲洗，编号装袋，保存于-80 ℃冰箱.

1.2样品制备

称取适量组织，按1∶3 g/mL比例加入4 ℃预冷的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0 ），用玻璃匀浆器冰浴中充分匀浆后置离心管中，于4 ℃，15 000 r/min离心30 min，取上清液，置于1.5 mL离心管中（肝脏离心两次，以去脂肪）.加入等体积40%蔗糖及2.5 μL溴酚蓝指示剂混匀，-80 ℃超低温冰箱中保存直至电泳前取出于-22 ℃冰箱中备用.

1.3电泳溶液配制

1.3.1电泳缓冲液配制

（1） 分离胶缓冲液TM1：Tris 72.6 g，加蒸馏水至180 mL，充分溶解，用1 mol/L HCl调节pH值至8.9，定容到200 mL.

（2） 浓缩胶缓冲液TM2：Tris 6.05 g，加蒸馏水溶解至180 mL，用1 mol/L HCl调节pH至6.7，定容到200 mL.

（3） 电极缓冲液TG：Tris 6 g， Gly 28.8 g，蒸馏水溶解，调pH至8.3，定容到1 L.

1.3.2凝胶制备

（1） 30%凝胶储液配制：Acr 90 g， Bis 2.4 g，加蒸馏水至300 mL，37 ℃温浴溶解，查证pH

（2） 分离胶（30 mL）和浓缩胶（10 mL）配制方法见表1.

表1分离胶和浓缩胶的配制

Tab.1Formula of separathion gel and spacerge gel

储藏液分离胶7.5%

体积/mL分离胶8.5%

体积/mL储藏液浓缩胶3.5%

体积/mLTM13.754.25TM21.7530%凝胶储液7.508.5030%凝胶储液1.16TEMED0.0150.017TEMED0.005ddH2O18.6917.1ddH2O7.0510%AP0.15 0.1710%AP0.051.4电泳

采用聚丙烯酰胺垂直板不连续电泳法，所分析酶的名称、缩写和编号见表2.

表2实验所分析同工酶的名称、编号及结构

Tab.2Names， abbreviations， numbers and structure of enzymes used for the test of three species of Theraponidae

酶名称缩写酶编号结构酶名称缩写酶编号结构乙醇脱氢酶ADH1.1.1.1D苹果酸酶ME1.1.1.40D酯酶EST3.1.1.1M/D过氧化物酶POD1.11.1.7D葡萄糖脱氢酶GDH1.1.1.118D山梨醇脱氢酶SDH1.1.1.14D乳酸脱氢酶LDH1.1.1.27T超氧物歧化酶SOD1.15.1.1D苹果酸脱氢酶MDH1.1.1.37D注：D二聚体；M单体；T四聚体.

1.5染色

显色方法参照小川和郎[12]等的方法稍做修改.按下列显色系统进行：

（1）乙醇脱氢酶（ADH）

染色液配制：0.05 mol/L TrisHCl（pH8.0） 48 mL，无水乙醇0.2 mL，1%NAD 1 mL， 1%NBT 1 mL，染色前加1%PMS 0.2 mL，搅拌混匀.显色：将电泳后的胶板浸入染色液，于暗室37 ℃保温直至显示深蓝色区带.

（2）酯酶（EST）

染色液配制：0.1 mol/L TrisHCl（pH7.1） 47 mL，1%α乙酸萘酯 1 mL，1%β乙酸萘酯 1 mL，1%固蓝RR盐 1 mL，搅拌混匀.显色：将电泳后的胶板浸入染色液，室温下直至显示棕色或红棕色区带.

（3）葡萄糖脱氢酶（GDH）

染色液配制：0.1 mol/L TrisHCl（pH8.0） 43 mL，葡萄糖9 g，1%NAD 1 mL， 1%NBT 1 mL，染色前加1%PMS 0.2 mL，搅拌混匀.显色：将电泳后的胶板浸入染色液，室温下直至显示蓝色区带.

（4）乳酸脱氢酶（LDH）

染色液配制： 0.1 mol/L TrisHCl（pH7.1） 43 mL，1 mol/L 乳酸钠（pH7.0） 5 mL，1%NAD 1 mL， 1%NBT 1 mL，染色前加1%PMS 0.2 mL，搅拌混匀.显色：将电泳后的胶板浸入染色液，于暗室37 ℃保温直至显示蓝紫色区带.

（5）苹果酸酶（ME）

染色液配制：0.05 mol/L TrisHCl（pH8.0） 42 mL，2 mol/L DL苹果酸钠（pH8.0） 5 mL，10%MgCl2 0.5 mL，05%NADP 1 mL，1%NBT 1 mL，染色前加1%PMS 0.2 mL，搅拌混匀.显色：将电泳后的胶板浸入染色液，于暗室37 ℃保温直至显示深蓝色区带.

鱼类的ME为四聚体，也可分为细胞质型（ sME） 和线粒体型（mME）两种[15].本研究中的3种_科鱼类ME酶谱中，位点mMe1在肝脏中活性最强，脑、心脏和肾次之._的所有被检测组织中都有表达，在眼中最弱，而在细鳞_和列牙_的眼中没有检测到其活性.sMe1组织特异性较强，只在肝脏中有表达.

3种_科鱼SOD有sSod1和mSod1两位点，都为二聚体.sSod1在6种组织中都有检出，肝脏活性最强，肌肉中活性最弱； mSod1在肝脏中活性最强，心脏中表达最弱.

2.2遗传多样性

依据组织特异性分析结果选取肝脏对3种_科鱼类8种同工酶（EST，GDH，LDH，MDH，ME，POD，SDH，SOD）进行群体遗传结构分析.

2.2.1酯酶（Esterase，EST）EST是催化酯类化合物水解并进入中间代谢的重要酶系，认为可能与机体的解毒作用密切相关[16].鱼类的EST 多为单体，一般由两个以上的位点编码，多态现象相当广泛.从本实验的 EST 电泳图谱中可以看出在6个位点中，Est3和Est4活性最强，Est6表达最广.

表33种_科鱼类9种同工酶的组织表达情况

Tab.3Activities of nine enzymes in tissues of three species of Theraponidae

器官或组织ADHESTGDHLDHMDHMEPODSDHSOD脑xll0*0*********0**lyl0**0********0**la0*0*********0**眼xll0**0*****0*0**lyl0*0****0*0**la0*0*******0**心脏xll0*0*********0*lyl0*0**********0*la0*0**********0*肾xll0***0********0**lyl0**0**********0**la0***0*******0**肝脏xll**********************lyl***********************la************************肌肉xll0*0****000**lyl0*0******00**la0*0****000**注：***： 强； **： 中； *： 弱； 0： 无；xll：细鳞_；lyl：列牙_；la：_.

2.2.2葡萄糖脱氢酶（Glucose dehydrogenase，GDH）葡萄糖脱氢酶是磷酸戊糖途径的关键酶，帮助脂肪酸和固醇合成.GDH为二聚体酶，由1个基因位点编码.

2.2.3乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）LDH是参与糖酵解的酶，可使细胞在氧气不足时仍能进行正常的生理活动[17].鱼类的LDH为四聚体，由A，B和C共3个位点控制，A和B两个位点编码的亚基能形成A4，A3B，A2B2，AB3和B4 5种多肽聚合体，C位点仅在肝、眼等特异性组织中存在.LDH在3种_科鱼类各组织中广泛存在，在心、肝、脑中活性较强.

2.2.4苹果酸脱氢酶（Malate dehydrogenate，MDH）MDH 是细胞中三羧酸循环重要的脱氢酶之一[18].硬骨鱼类的MDH分为上清液型（sMDH） 和线粒体型（mMDH）两种，均为二聚体.在3种_科鱼类的各组织中都有表达，组织间的特异性不明显（图7）.

2.2.5苹果酸酶（Malic enzyme， ME）ME是生物氧化的重要酶类.鱼类的ME为四聚体.本研究中的3种_科鱼类ME酶谱中，位点Me1在肝脏中活性最强，Me2组织特异性较强，只在肝脏中有表达.

2.2.6过氧化物酶（Peroxidase，POD）该酶在H2O2的存在下催化一系列氧化反应.一般认为，植物的POD由一个位点控制，为单体或二聚体，近年来在鱼类中的研究逐渐增多，大多认为可能由两个位点编码且为二聚体[18]._科鱼类POD酶谱可能由6个位点控制，其中Pod2和Pod3表达的范围比较广也比较稳定.在分析的6种组织中，心脏和肾脏活性最强，肝脏和脑、眼的活性次之，肌肉中不表达（图8）.

图7_科鱼类群体苹果酸脱氢酶电泳图

Fig.7Eelectrophorogram of MDH in species of Theraponidae图8_科鱼类群体过氧化物酶电泳图

Fig.8Eelectrophorogram of POD in species of Theraponidae2.2.7山梨醇脱氢酶（Sorbitol dehydrogenase，SDH）SDH与山梨醇代谢有关，除山梨醇外，还对一些糖醇的氧化有催化作用[19].3种_科鱼类的SDH只在肝脏中有检出，由一个基因座位Sdh1，2编码（图9）.

图9_科鱼类群体山梨醇脱氢酶电泳图

Fig.9Eelectrophorogram of SDH in species of Theraponidae2.2.8超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）SOD能清除体内产生的氧自由基O2-，是生物体防御氧化损伤的重要酶类，为二聚体酶，有两个基因座位编码，可分为线粒体型和上清液型[19].

本研究共记录了15 个基因座位，其中呈多态性的座位有2个（Pod2、sSod1），多态座位比例（P）为0133，位点平均有效等位基因数（Ae）分别1.004，0.997和1.015，平均每个位点预期杂合度（He）值分别为0.068，0.066和0.045，平均每个位点实际杂合度（Ho）值分别为0.098，0.083，0.08.sSod1和pod2遗传偏离指数（d）大于零，等位基因频率分布偏离HardyWeinberg 平衡，表明该位点处于杂合子过剩状态（表4） .