3,5-二硝基水杨酸比色法测定黄芪多糖的含量

【摘要】目的：建立黄芪有效部位多糖的含量测定方法。方法：用优化后的3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定黄芪有效部位多糖的含量。结果：DNS试剂的用量为2ml，显色温度为100℃，显色时间为5min，在500nm处多糖含量与吸光度有良好的线性关系，平均回收率为100.6%，RSD=1.79%（n=5）。结论：该方法操作简便，测定结果准确，重复性好，可用于测定黄芪多糖的含量。

【关键词】黄芪;多糖;3,5-二硝基水杨酸法

【中图分类号】R931.5【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)08-0013-02

Determination of Polysaccharides in Astragalus membranaceus with DNS Method

XIA Chun-seng1WEI Shi-li2ZHONG Yan-hong1

(1. Yangtze River Pharmaceutical Holding Guangzhou Hairui Pharmaceutical CO.,Ltd, Guangzhou 510663,China;

2.New Drug Research and Development Center, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510405,China)

【Abstract】 Objective To establish a method for the determination of polysaccharides in Astragalus membranaceus. Method Using optimized DNS colorimetric method to determine the polysaccharides. Result The conditions were as follows: 3,5-dinitrosalicylic acid 2.0ml,aqueous bath temperature 100℃, and active time 5min.There was a good liner relationship between the concentration of polysaccharides and the absorbance at the wavelength of 500nm. The average recovery was 100.6%, RSD=1.79%(n=5).Conclusion The method is convenient, accurate with good reproducibility and can be used for the determination of polysaccharides in Astragalus membranaceus.

【Keywords】polysaccharide;Astragalus membranaceus;3,5-dinitrosalicylic acid colorimetry

黄芪是豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.Var.mongholicus(Bge.) Hisao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.的干燥根，具补中益气、升阳固表 、托毒生肌、利水退肿之功[1]。黄芪多糖是黄芪的有效成分之一，现代药理学研究表明，具有抗衰老 、抗过氧化、 促进免疫功能活性、改善心血管功能[2] 、抗肿瘤等作用[3]。多糖的检测方法可分为二大类。一类是直接测定多糖本身，如高效液相色谱法和酶法；另一类是利用苯酚-硫酸法、硫酸-蒽酮法、3,5-二硝基水杨酸法等测定多糖。前者需昂贵的仪器、多糖纯品和特定的酶，而且操作繁琐，在应用中受到限制；后者方法简单、快速。本文采用3,5-二硝基水杨酸法测定黄芪有效部位多糖的含量。

1材料与仪器

1.1仪器HH-S恒温水浴锅（江苏省金坛市正基仪器有限公司）；AB204-N电子分析天平（梅特勒-托利多公司）；Thermo Helios型紫外分光光度计（美国UNICAM公司）。

1.2材料D-无水葡萄糖对照品（中国生物制品检定所，批号为110833-200503）；黄芪粗多糖（扬子江药业集团有限公司，批号为081008，0081012，081017，081022）；3,5-二硝基水杨酸（批号：20061211，广东光华化学厂有限公司）；其它试剂均为分析纯。

1.33,5-二硝基水杨酸试液的配制[4]甲液：称取6.9g苯酚溶于10%氢氧化钠的溶液15.2ml中，用水稀释至69ml，并在此溶液中加入6.9g亚硫酸氢钠；乙液:称取255g酒石酸钾钠加至300ml30%氢氧化钠溶液中，再加880ml1%3,5-二硝基水杨酸溶液，混匀，即得。甲液与乙液混合，储存于棕色瓶中，7天后使用。

2方法与结果

2.1对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷干燥的D-无水葡萄糖对照品10.2mg，置于50ml容量瓶中，加适量水溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

2.2供试品溶液的制备精密称取黄芪粗多糖约35mg，置于25ml容量瓶中，加适量水溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.1总糖溶液的制备[5，6]精密量取供试品溶液2.5ml，置于25ml容量瓶中，加水使成5ml，加6mol/L盐酸溶液5ml，在沸水浴中加热30min，用流水冷却后加酚酞指示液1滴，用20%氢氧化钠溶液调节至微红色，加水至刻度，摇匀，即得。

2.2.2单糖溶液的制备[5，6]精密量取供试品溶液5ml，置于10ml容量瓶中，加酚酞指示液1滴，用20%氢氧化钠溶液调节至微红色，加水至刻度，摇匀，即得。

2.3测定方法

2.3.1最大吸收波长的确定精密量取对照品溶液0.8ml、总糖溶液和单糖溶液各2ml，分别置于10ml具塞刻度试管中，加水使成2ml，分别精密加入3,5-二硝基水杨酸试液2ml，混匀，在100℃水浴中加热5min，取出，立即用冰水浴冷却至室温，加水3ml，摇匀，用相应的试剂作空白，照分光光度法在400～600nm的波长范围扫描。对照品溶液、总糖溶液和单糖溶液均在500nm有最大吸收，扫描图见图1。

2.3.2标准曲线的绘制精密量取对照品溶液0.0，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2ml，分别置于10ml刻度试管中，照“2.3.1”项下自“加水使成2ml”起，依法显色，在500nm测定吸收度，结果见表1，绘制标准曲线，回归方程Y=32.838X-0.2474，R2=0.9995，在11.7μg/ml～35.0μg/ml内线性关系良好。

2.3.3稳定性试验精密量取对照品溶液0.8ml、总糖溶液和单糖溶液各2ml，分别置于10ml具塞刻度试管中，照“2.3.1”项下自“加水使成2ml”起，依法显色，分别于0、0.5、1.0、1.5、2.0小时测定吸收度。结果对照品溶液吸收度平均值为0.529，RSD%=1.14%（n=5）；总糖吸收度平均值为0.518，RSD%=1.59%（n=5）；单糖吸收度平均值为0.233，RSD%=1.71%（n=5）。说明本品在2小时内显色稳定。

2.3.4精密度试验精密量取总糖溶液和单糖溶液2ml，各5份，分别置于10ml具塞刻度试管中，照“2.3.1”项下自“加水使成2ml”起，依法显色，测定吸收度。结果总糖吸收度平均值为0.524，RSD%=1.06%（n=5）；单糖吸收度平均值为0.231，RSD%=1.37%（n=5）。说明本法精密度良好。

2.3.5重复性试验取同一批的黄芪粗多糖样品制备供试品溶液5份，进行含量测定。结果样品中多糖含量平均为51.1%，RSD%=1.92%。

2.3.6样品加样回收试验[5]精密称取黄芪粗多糖（批号：070408）5份，每份约17.5mg，精密加入对照品适量，按含量测定方法测定，结果表明本法回收率良好，见表2。

2.3.7样品多糖含量测定精密量取总糖溶液和单糖溶液2ml，分别置于10ml具塞刻度试管中，照“2.3.1”项下自“加水使成2ml”起，依法显色，测定吸收度，从标准曲线中回归方程计算出总糖和单糖含量，由总糖含量减去单糖含量，即得多糖的含量。对4批样品进行多糖含量测定，结果见表3。

3讨论

3.1多糖含量测定方法的选择测定黄芪多糖含量的方法，还有苯酚-硫酸法、硫酸-蒽酮法[7]，这两种方法测定多糖含量时，无法去掉单糖成分的干扰，测定结果比实际含量偏高，而且两种方法都用到硫酸，硫酸遇水剧烈放热，从而显色条件难以控制，影响测定结果，导致线性考察不稳定，高浓度硫酸具有严重的腐蚀性，不便操作。与前两种方法比较，3,5-二硝基水杨酸法试剂较稳定，操作简便、快速，灵敏度高，在去除了单糖成分的干扰之后，测定结果准确，能够广泛应用。

3.2显色条件的考察

3.2.1反应时间精密吸取对照品溶液0.8ml，平行5份，置于10ml具塞刻度试管中，加水使成2ml，精密加入3,5-二硝基水杨酸试液2.0ml，混匀，分别在100℃水浴中加热1、3、5、7、9min，取出，立即用冰水浴冷却至室温，加水3.0ml，摇匀，用相应的试剂作空白，在500nm测定吸收度。反应1min吸光度很小，反应3min以后，吸光度基本无变化，综合考虑，选择5min为反应时间。

3.2.2反应温度精密吸取对照品溶液0.8ml，平行5份，置于10ml具塞刻度试管中，加水使成2ml，精密加入3,5-二硝基水杨酸试液2.0ml，混匀，分别在60、70、80、90℃和沸水浴中加热5min，取出，立即用冰水浴冷却至室温，加水3.0ml，摇匀，用相应的试剂作空白，在500nm测定吸收度。反应温度为60、70、80℃时，吸光度较低，90℃和沸水浴时吸光度较高但相差不大，综合考虑，选择沸水浴为反应温度。

参考文献

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(收稿日期：2009.02.15)