时间：2022-09-06 06:18:26
[摘要] 目的 探讨去甲基化药物5-氮杂-2’-脱氧胞苷（简称5-Aza）对转录调节因子Snail的作用，转染反义Snail与5-Aza对上皮间质转化相关膜蛋白E-钙粘素的mRNA水平的影响及二者联合作用的可能机制。 方法 应用MTT、PCR、实时荧光定量PCR、检测低分化胃腺癌细胞株分别转染反义Snail、应用5-Aza单独或协同干预后对细胞的生长增殖及Snail、E-钙粘素mRNA表达的影响。结果 与空白对照组比较5-Aza干预、转染反义Snail分别及二者共同干预均增加E-cadherin的mRNA的表达，空质粒组无显著差异。5-Aza上调Snail基因mRNA的表达。两种干预方式处理均能抑制胃癌细胞的生长。 结论5-Aza、转染反义Snail均使E-cadherin mRNA表达增强，且药物作用呈时间浓度依赖性。5-Aza能上调Snail基因的表达，提示甲基化作用在同时下调转录调节子Snail基因表达和抑制E-钙粘素表达。
[关键词] 胃癌；反义Snail（Antisense Snail）；5-氮杂-2’脱氧胞苷（5-Aza）；E-钙粘素（简称E-cad）
[中图分类号] R4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2013）08（a）-0004-02
在我国胃癌发生率和死亡率均居世界首位[1]，胃癌患者多死于肿瘤转移。肿瘤早期E-cad表达下调，细胞间粘附如N-钙粘素表达增强即发生EMT（内皮间质转化），肿瘤细胞具有了侵袭和转移的功能，远处转移的中粒细胞E-cadherin重新表达[2]。E-cad的变化是某些肿瘤发生EMT时的启动步骤，E-cad的调节涉及多条分子途径，Snail是多种分子途径的关键环节[3]，甲基化是肿瘤发生EMT的另一重要因素，而甲基化作用在肿瘤EMT发生时具体的分子机制尚未报道[4]，其与Snail的关系国内外研究较少，对多能干细胞、滋养层细胞及卵巢癌细胞的研究表明[5]，甲基化与EMT的发生有关，同时与Snail基因的转录有关。研究肿瘤发生时甲基化水平可帮助诊断疾病的发生，EMT时甲基化作用的分子机制也为揭示肿瘤转移机制及针对肿瘤转移的治疗提供依据。现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
胃癌细胞株BGC823购自博士德生物技术有限公司，Anti-Snail pcDNA3.1质粒构建及引物合成委托上海生工合成部完成。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 BGC823含10%胎牛血清、RMPI-1640培养基于37℃.含5%CO2孵箱中培养。
1.2.2 摇菌提取质粒 常规方法摇菌，按Omega去内毒素质粒提取试剂说明，进行Anti-Snail pcDNA3.1质粒和空白质粒抽提，琼脂糖凝胶电泳，回收质粒测序。
1.2.3 药物、质粒干预 取对数生长期细胞，调整细胞密度为5×104/cm2，0.2 mL/孔接种于96孔板中，配制5-Aza（sigma）终浓度为0.1 mM（0.1 mmol/L）、2.5 mM、5.0 mM的培养基，200 uL/孔加入96孔板，每个浓度设5个复孔。质粒混合物：分别将lulAntisnail质粒（1 ug/uL）、1 uL空白质粒和X-teremGene HP（Roch公司）按1∶3比例配制，与1 00 uL无血清培养基混匀，逐滴加入培养孔中，每组设5个复孔，设空白对照。将96孔板置于37 ℃含5%CO2孵箱中培养分别作用12、24、48 h。
1.2.4 MTT法 终止培养前4 h，加入MTT（sigma）（5 mg/mL）20 uL/孔，继续培养4 h后小心吸取上清，加DMSO150 uL孔 ，置酶标仪上读数，记录各孔光吸收值，以时间为横坐标，吸光度A值作为纵坐标绘制肿瘤细胞生长曲线。
1.2.5 Real-time PCR测E-cadherin 和Snail mRNA表达 瞬时转染Antisnail-pcDNA3.1和2.5M 5-Aza处理12 h、24 h、48 h时收集BGC823细胞，RNasio （Takara）提取各组mRNA，反转录为cDNA，分别进行qRT-PCR反应，3组引物序列：
Realtime-PCR反应条件：
0.2 mLPCR薄壁管分别编号，加入 2×qPCR Master Mix（Omega公司）12.5 uL，正反向引物混合物各0.5 uL， cDNA 1 uL。一管不加模板作阴性对照，补加DEPC水至 25 uL混匀。95 ℃ 5 min 预变性后，95 ℃15s58 ℃20s72 ℃20s，40cycles。反应结果经Max-Pro软件分析。
1.3 统计方法
采用SPSS17.0统计软件对数据进行分析，所有数据用均数±标准差（x±s）表示，各组间采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 转染反义snail质粒与5-Aza分别作用对BGC823生长的抑制作用
3组浓度5-Aza、转染Anti-snail pcDNA3.1分别作用12 h、24 h、48 h时，各组对低分化胃腺癌细胞株生长均具有抑制作用，且药物干预具有浓度时间依赖性，5-Aza浓度为2.5mM，作用48 h肿瘤生长抑制作用最明显。
2.2 各干预组对E-钙粘素mRNA表达的影响
2.5A、5.0A、转染AntiSnail pcDNA3.1组及2.5A与转染Antisnail pcDNA3.1联合分别作用48 h后均使细胞E-粘素基因mRNA重新高表达，5-Aza同时使上调Snail表达，转染空白质粒组较对照组无明显变化。药物干预呈浓度-时间依赖性，2.5A作用48 h，E-钙粘素表达明显增加，转染Antisnail-pcDNA3.1组48 h最大上调E-钙粘素基因表达。
2.3 5-Aza对转录调节因子Snail基因表达的影响
转染Anti-snail pcDN3.1组Snail mRNA表达明显降低，与DMSO比较2.5A作用于低分化胃腺癌细胞株48 h，Snail基因mRNA表达显著增高（图2.3），差异有统计学意义。
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图1 E-钙粘素mRNASnail mRNA
图2 DMSO2.5A
图2.2显示：0.1A、2.5A、5.0A分别作用于胃癌细胞株BGC823 48 h Snail、E-cad mRNA含量的变化。
3 讨论
甲基化[6] 和转录调节子在调节E-钙粘素转录中发挥重要作用，转录调节子snail在多种肿瘤细胞中的过表达，如肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、结肠癌等肿瘤与E-cadherin的表达呈负相关[7]。启动子甲基化能抑制E-钙粘素的表达，但甲基化并不总是伴有E-钙粘素表达缺失，如在结直肠癌细胞中，甲基化与E-钙粘素表达增高有关，提示其他表观机制如脱乙酰化与E-钙粘素调节相关[8-10]。甲基化与Snail的关系报道较少，早期在鼠的皮肤癌研究发现，Snail基因的表达也与甲基化有关[11]。2012年Ying Chen[12]等在滋养层细胞的实验表明： Snail基因第一个内含子区甲基化与Snail的转录调节有关，同时E-钙粘素邻近启动子甲基化参与下调其表达，提示异常甲基化与胚胎形成时疾病发生相关。
该实验对低分化胃腺癌细胞株BGC823的研究证实：去甲基化药物5-Aza-2’-CdR 能重新诱导低分化胃腺癌细胞株E-钙粘素的表达，去甲基化作用也使Snail基因表达增加，反义Snail的过表达显著上调低分化胃腺癌细胞E-cadherin的表达，与Ying Chen等在滋养层和多功能干细胞的研究比较，研究了胃癌细胞内而甲基化作用在Snail基因表达抑制和E-钙粘素的表达下调过程中发挥双重作用。同时，由该组数据得出：5-Aza与反义Snail均能抑制低分化胃腺癌细胞的生长，5-Aza在2.5 mM 48 h对低分化胃腺癌的生长抑制达最大值。
该实验得出：转录调节因子Snail显著抑制低分化胃癌细胞E-钙粘素的表达，甲基化作用抑制Snail基因的表达同时启动子的甲基化也使E-钙粘素表达沉默，提示在低分化胃腺癌细胞中E-钙粘素表达主要受转录调节子Snail下调和甲基化双重作用，而甲基化作用在Snail基因表达抑制和E-钙粘素的表达下调过程中发挥双重作用，基因的甲基化水平为肿瘤发生早期提供诊断依据，揭示去甲基化药物调节E-cad表达的可能分子机制。
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（收稿日期：2013-06-17）