金雀异黄素对脂多糖诱导人肺泡上皮细胞A549炎症及凋亡的影响

摘要：目的 观察金雀异黄素对脂多糖（LPS）诱导人肺泡上皮细胞A549发生炎症与凋亡的影响，探讨其改善肺损伤的作用机制。方法 CCK-8法检测不同浓度金雀异黄素和/或LPS干预细胞12 h后的活力；RT-PCR检测金雀异黄素对LPS诱导的炎性因子白细胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达；TUNEL法检测细胞凋亡；Western blot检测信号通路的变化。结果 金雀异黄素（1、5、10 μmol/L）对细胞活力无明显影响，LPS（1 μg/mL）可显著降低细胞活力，而金雀异黄素与LPS共同干预则细胞活力呈浓度依赖性升高；RT-PCR结果显示，LPS可显著提高炎性因子的基因表达，而金雀异黄素则可呈浓度依赖和时间依赖抑制其表达；TUNEL染色结果显示，金雀异黄素（10 μmol/L）与LPS联合干预12 h可显著减少LPS诱导的细胞凋亡；Western blot结果显示，金雀异黄素（10 μmol/L）与LPS（1 μg/mL）协同刺激A549细胞30 min可显著抑制LPS诱导的IκBα、p65信号通路的磷酸化水平。结论 金雀异黄素可抑制LPS诱导的人肺泡上皮细胞发生炎症和凋亡，从而发挥保护作用。

关键词：金雀异黄素；急性肺损伤；A549细胞；炎症；细胞凋亡

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.03.014

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）03-0057-04

Effects of Genistein on Inflammation and Apoptosis of Human Alveolar Epithelial Cell A549 Induced by Lipopolysaccharide WANG Ling1， LIU Hui-guo2 （1. The Hospital of Wuhan University， Wuhan 430071， China； 2. Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College of HUST， Wuhan 430030， China）

Abstract： Objective To investigate the effects of Genistein （GEN） acting on human lung adenocarcinoma A549 cells induced by LPS； To discuss its action of mechanism for improving injuries of lung. Methods The activity of cell treated with different concentrations of Genistein was detected by CCK-8 method and / or LPS intervention for 12 h. The expressions of inflammatory cytokines IL-1β， IL-6， and TNF-α induced by LPS were detected by RT-PCR. TUNEL was used to detect apoptosis， and Western blot was used to detect the changes of signal pathway. Results GEN （1， 5， 10 μmol/L） alone had no effects on cell activity； LPS （1 μg/mL） reduced cell viability significantly， while co-treated the A549 cells with GEN and LPS could reverse this condition in a concentration-dependent manner； RT-PCR results showed that LPS could significantly increase the level of gene expression of inflammatory factors， while GEN could inhibited this phenomenon in both concentration-and time-dependent manner； the results of TUNEL staining showed that GEN （10 μmol/L） combined with LPS for 12 h could significantly decrease the apoptosis rate； the results of Western blot showed that GEN possibly inhibited the inflammation and apoptosis through inhibiting the phosphorylation of IκBα， p65 signaling pathways. Conclusion GEN has anti-inflammation and anti-apoptosis effects on A549 cells induced by LPS， so as to play a protective rate.

Key words： Genistein； acute lung injury； A549； inflammation； apoptosis

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）的死亡率较高，其主要特点为中性粒细胞的聚集、间质水肿、肺泡上皮细胞完整性破坏及大量炎性因子的产生[1]。虽然近些年来对ALI的发病机制研究已经有了长足进步，但目前的治疗并未降低ALI患者死亡率及增加幸存者生活质量[2]。脂多糖（LPS）为革兰阴性细菌细胞壁的组成成分，可诱导炎性反应继而导致免疫功能障碍[3]。LPS气管内给药可造成严重肺损伤模型，近年来已经成为共识[4]。因此，我们采用LPS体外干预肺泡上皮细胞模拟肺损伤模型。核因子-κB（NF-κB）在{控炎症反应过程中发挥关键作用[5]。多项研究表明，NF-κB信号通路在肺部损伤疾病中发挥重要调控作用，其诱导的细胞因子如白细胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在ALI的发病过程中发挥关键作用[6]。

金雀异黄素（genistein，GEN）是一种存在于豆科植物和齿状植物中的天然异黄酮化合物，研究表明，其具有抗癌、抗炎、抗氧化等作用[7-8]，但其是否影响ALI中肺泡上皮细胞的炎性反应尚未见报道。本实验观察GEN对肺泡Ⅱ型上皮细胞在LPS诱导下发生上皮损伤的影响，探讨其改善ALI的作用机制。

1 实验材料

1.1 药物及制备

GEN，上海融禾医药科技发展有限公司，货号446-72-0，纯度>98%。取2.7 mgGEN溶于1 mL二甲基亚砜（DMSO）中配制实验所用的母液。

1.2 细胞

A549人肺泡Ⅱ型上皮细胞株，中国科学院上海细胞库，细胞培养和干预刺激均在独立的细胞房中进行，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞生长达次融合状态时0.25%胰蛋白酶消化，根据实验需要接种于不同的培养皿中。分组诱导前以无血清培养基饥饿24 h，以减少血清对刺激因素的影响。

1.3 主要试剂与仪器

高糖DMEM basic（1×）培养基、新生小牛血清（New born serum，NBS）、胰酶，Gibco公司；CCK-8试剂盒，日本同仁化学研究所；LPS，Sigma公司；RT-PCR试剂盒，Roche公司；p-IκBα、p-p65、IκBα、p65、GAPDH（Rabbit IgG），Cell Signaling Technology公司。多功能微孔板检测系统Synergy HT（美国BioTek公司），紫外分光光度计NANODROP 2000c（Thermo scientific），实时定量PCR仪Light Lycler 480（Roche公司），RT反转录仪Veriti 96 well Thermal Lycler（Applied Biosystems公司），倒置相差显微镜（日本OLYMPUS），恒温培养箱（日本SANYO公司）。

2 实验方法

2.1 细胞处理和分组

待A549细胞贴壁生长密度达80%时，弃去培养基，PBS清洗，加入饥饿液，置于温箱8 h后置换为含有LPS（1 μg/mL）的饥饿液，重新置于温箱中培养，收取蛋白质和RNA样本。实验分为对照组、LPS组、LPS+GEN 1 μmol/L组、LPS+GEN 5 μmol/L组、LPS+GEN 10 μmol/L组和GEN 10 μmol/L组。

2.2 CCK-8法检测细胞活力

细胞被接种至96孔板，每孔100 μL，密度大约为2×105个/mL，置于温箱继续培养24 h，将培养基更换为无血清的培养基饥饿24 h，采用不同处理因素干预72 h后，将96孔板中培养基换为含10 μL CCK-8的无血清培养基100 μL，温箱中孵育2～2.5 h后于酶标仪波长450 nm处进行测定。

2.3 Western blot检测信号通路磷酸化水平

冰上裂解细胞10 min，置于1.5 mL离心管中，超声裂解仪5 kHz裂解10～15 s，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，上清液移至离心管中，BCA定量检测蛋白浓度并将蛋白浓度调整一致后置于煮沸仪上将其变性。每组样本混匀后取10 μL行10%SDS-PAGE凝胶电泳，检测内参指标GAPDH，根据各样本的光密度值调整上样剂量，使其与GAPDH的光密度值保持一致，后每组以校正后的上样剂量进行凝胶电泳，将蛋白以100 V、90 min移至PVDF膜上，用一抗封闭液封闭12 h，一抗包括p-IκBα、p-p65、IκBα、p65，再用TBST洗3次，将其放入对应的加有二抗的稀释液中避光孵育1 h，二抗为Alexa Fluor? 488 goat anti-Rabbit IgG，再用TBST洗3次，放入荧光检测仪中，检测目的条带，应用Odyssey图像分析软件检测各组蛋白的光密度值，作为蛋白表达水平。

2.4 RT-PCR检测炎性因子基因表达

细胞以不同因素处理后，弃去培养基，以Trizol法提取细胞总RNA，采用紫外分光光度法测定其含量与纯度。根据样本所测浓度，取适当剂量，将各样本浓度调整一致后反转录为cDNA。以GAPDH为内参照，采用20 μL体系进行PCR扩增。反应条件为：94 ℃、2 min，1个循环，94 ℃、40 s，25～35个循环，50～65 ℃、40 s，72 ℃、1 min，72 ℃、5 min，1个循环。引物序列见表1。

2.5 TUNEL染色检测细胞凋亡

将细胞接种至爬片上，调整密度为1×105个/mL，饥饿18 h，加入不同干预因素处理细胞12 h，PBS洗3次，1%多聚甲醛固定10 min，再用乙醇/乙酸2∶1混合液-20 ℃固定5 min，PBS清洗3 min。加入平衡液室温孵育10 s后滴加TdT酶工作液，37 ℃孵育1 h。加入工作液，振荡15 s后孵育10 min，PBS洗3次，吸干液体，滴加Anti-Digoxigenin Fluorescein工作液，避光孵育30 min，PBS再洗3次，DAPI封片，镜下观察拍照。正常细胞核被染为蓝色，凋亡细胞核被染为绿色，每组随机选择8个视野，计算细胞凋亡率（凋亡细胞数÷细胞总数×100%），取其平均值。

3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以―x±s表示，多组间均数比较采用方差分析，组间两两均数比较采用SNK法（方差齐）或Dunnett's T3（方差不齐）检验。P

4 结果

4.1 金雀异黄素对A549细胞活力的影响

c对照组比较，GEN（1、5、10 μmol/L）单独干预A549细胞对其活力无影响；GEN（1、5、10 μmol/L）与LPS同时干预A549细胞则细胞活力明显升高（P

4.2 金雀异黄素对脂多糖诱导A549细胞炎性因子的影响

与对照组比较，LPS（1 μg/mL）处理12 h后A549细胞炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α基因表达显著增加（P

注：与对照组比较，**P

与对照组比较，LPS干预3、6、12 h后A549细胞炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α基因表达明显升高（P

4.3 金雀异黄素对脂多糖诱导A549细胞凋亡的影响

与对照组比较，LPS（1 μg/mL）干预细胞12 h后凋亡率为42.3%，GEN（10 μmol/L）与LPS同时干预A549细胞后凋亡率降为13.6%，GEN（10 μmol/L）单独干预A549细胞对细胞凋亡无影响。结果见图1。

4.4 金雀异黄素对脂多糖诱导A549细胞IκBα、p65信号通路磷酸化水平的影响

GEN（10 μmol/L）与LPS（1 μg/mL）协同刺激A549细胞30 min可显著抑制LPS诱导IκBα、p65信号通路的磷酸化水平（P

1

5 讨论

本研究结果显示：LPS连续刺激A549细胞12 h可诱导其产生大量炎性因子且细胞凋亡率上升；RT-PCR结果提示，GEN可呈浓度依赖性及时间依赖性逆转炎性因子的上调；TUNEL染色结果提示，其亦可降低细胞凋亡率。Western blot检测结果显示，GEN可能是通过抑制NF-κB信号通路中的IκBα及p65的磷酸化而发挥保护作用。

有研究显示，GEN在急性和慢性炎症中均可发挥显著调控作用，作用靶点是通过抑制NF-κB及STAT信号通路的活化[9]。冯赞杰等[10]研究显示，GEN可抑制人血管平滑肌细胞中NF-κB的激活从而发挥抗动脉粥样硬化的作用，其亦可抑制大鼠关节炎滑膜细胞中IL-1β、TNF-α等炎症因子的产生。本实验选择GEN对ALI的体外细胞模型进行干预，通过预实验结果选择了3个药物浓度（1、5、10 μmol/L）来进行实验。

天然免疫在机体预防病原体侵袭发挥首当其冲的作用，LPS与之细胞膜上对应的Toll样受体相结合后可触发天然免疫反应，NF-κB信号通路的活化需要κB（IκBα和IκBβ）的磷酸化与降解。NF-κB主要由2个亚基（p65和p50）组成。IκBα与p65在细胞质中相结合，抑制NF-κB的细胞核转位，一旦NF-κB入核，其可调控细胞核转录细胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α及COX-2等。此外，LPS可增加细胞内活性氧的产生，增加线粒体膜电位的通透性，继而诱发内源性凋亡通路Caspase9的激活，细胞本身产生的TNF-α亦可作用于细胞膜，诱导外源性凋亡通路Caspase8的活化，2组凋亡通路均可通过Caspase3的活化而诱导细胞凋亡。本实验结果显示，GEN可显著抑制IκBα及p65的磷酸化水平，抑制NF-κB的核转位，其下游的炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平均被GEN所抑制，TUNEL染色提示LPS诱导的细胞凋亡也明显减少。因此，我们认为GEN可能通过抑制IκBα及p65的磷酸化从而发挥抗细胞炎症及凋亡的作用。

综上，GEN可抑制LPS诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞发生炎症与凋亡，为下一步动物在体研究提供了一定基础，但本研究对信号通路的具体机制阐述尚不明确，对线粒体膜电位及活性氧的产生亦未能明确，有待进一步实验，以明确GEN的具体作用机制。

参考文献：

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[7] 王玲，⒒怨.金雀异黄素对肺泡Ⅱ型上皮细胞发生上皮-间质转化的影响[J].中国中医药信息杂志，2016，23（10）：63-66.

[8] 金永生，刘超美.金雀异黄素的药理作用[J].国外医药：植物药分册， 2002，17（5）：190-193.

[9] 马莹莹，张育，许金鑫，等.金雀异黄素对CIA大鼠促炎和抗炎因子分泌的影响[J].实用药物与临床，2014，17（10）：1247-1251.

[10] 冯赞杰，卢志顺，刘洋，等.金雀异黄素抑制人血管平滑肌细胞中核因子κB的激活[J].中国动脉硬化杂志，2009，17（5）：363-366.

（收稿日期：2016-04-21）

（修回日期：2016-05-18；编辑：华强）