原花青素对大肠癌HT―29细胞增殖及Pim―1、Bcl―2、CyclinD1基因的影响研究

【摘要】目的探讨原花青素对大肠癌HT29细胞增殖及Pim1、Bcl2、CyclinD1基因的影响。方法取对数生长期HT29细胞，分别加入100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、800 mg/L原花青素培养，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖；采用荧光定量PCR检测Pim1、Bcl2、CyclinD1 mRNA表达。结果24 h时，各浓度组原花青素对HT29细胞增殖抑制率分别为 （428±034）%、（1005±061）%、（1667±063）%、（2816±091）%；48 h时，各浓度组原花青素对HT29细胞增殖抑制率分别为（1147±153）%、（1765±121）%、（3082±199）%、（4448±218）%，对Pim1、Bcl2、CyclinD1 mRNA表达有抑制作用（P< 005），且作用呈浓度依赖性。结论原花青素体外可呈浓度依赖性抑制HT29细胞增殖，其机制可能与抑制Pim1、Bcl2、CyclinD1表达有关。

【关键词】原花青素；大肠癌；HT29细胞株；细胞增殖

作者单位：524001广东医学院附属医院消化内科（魏国丽周宇），中医科（郑学宝刘强）原花青素（procyanidin，PA）是一种有特殊分子结构的多酚化合物，葡萄籽内含量最高，具有快速清除水溶性、脂溶性自由基、抗辐射、抗过敏、改善循环、延缓衰老、增强免疫力等功效。研究显示，PA对乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌等肿瘤均有显著抑制作用[1]。本研究旨在探讨PA对大肠癌HT29细胞增殖及Pim1、Bcl2、CyclinD1基因的影响，以期为PA用于治疗结肠癌治疗提供初步实验及理论依据。

1材料与方法

11实验材料药物和细胞株

PA（纯度>95%，陕西方晟科技有限公司）；人大肠癌HT29细胞株（中南大学湘雅中心实验室）。四甲基偶氮唑蓝（MTT）（武汉博士德生物工程有限公司）；RPMI 1640培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（FBS）（杭州四季青生物制品公司）；胰蛋白酶（trypsin）（美国Amresco公司）；二甲亚砜（DMSO）（德国WAK公司）；荧光定量PCR试剂盒（大连宝生物技术有限公司）；PCR引物由上海生物工程公司合成。ABI PRISM 7500 Sequence Detection System （SYBR Green PCR Master Mix，TOYOBO 公司）。

12实验方法

121细胞传代培养将人结肠癌HT29细胞置于含10%新生胎牛血清的RPMI1640培养基中，在37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中传代培养， 取对数生长期细胞用于实验。

122细胞增殖活性检测采用MTT法，调整细胞密度为1×104/ml 接种于96孔板上，200 μL/孔。待细胞贴壁后，实验组加入不同浓度PA（100、200、400、800 mg/L），对照组加无血清的RPMI 1640培养液（不含PA）。作用24 h、48 h后弃上清，加入无血清的RPMI1640培养液180 μL，同时加入5 mg/ml MTT 20 μL，37℃继续培养4 h。弃孔内上清液后，加入DMSO 150 μL 振荡10 min，使结晶充分溶解；490nm波长下，检测吸光值（A490），记录结果。计算公式：细胞增殖抑制率=（对照组吸光值实验组吸光值）/对照组吸光值×100%。

3讨论

原花青素是来源于多种植物的一大类酚类化合物，有广泛抗肿瘤活性。葡萄籽原花青素可抑制人乳腺癌、前列腺癌、皮肤癌等细胞株的细胞增殖，并诱导凋亡，其作用机制与Bcl2家族有关[1]。有研究发现，PA对大肠癌细胞HT29、SW480 与 LoVo的增殖抑制呈浓度依赖关系[2，3]。本研究取对数生长期HT29细胞分别加入100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、800 mg/L的PA培养，发现HT29细胞的增殖呈时间依赖性及浓度依赖性，随着PA浓度增加和作用时间延长，HT29细胞增殖的抑制率明显增高，与上述研究的结果一致，说明PA对HT29的增殖有抑制作用。

细胞过度增殖与肿瘤发生密切相关，Pim1、Bcl2、CyclinD1在调控细胞的增殖、分化、凋亡等过程中发挥了重要作用，其表达异常与结肠癌等各种恶性肿瘤的发生有密切关系。Pim1是丝/苏氨酸激酶Pim家族的第一位成员，其过度表达可阻断多种凋亡诱导通路、干扰细胞周期的正常调控，导致结肠癌细胞过度增殖[4]。Bcl2是凋亡抑制基因，其功能是通过阻断程序性凋亡过程促进结肠癌细胞增殖、生长[5，6]。研究表明Pim1诱导细胞凋亡的机制之一是直接磷酸化Bcl2家族促凋亡成员Bad，使之失去与Bcl2的结合能力，从而解除Bad对Bcl2的抑制作用，最终导致结肠癌的发生[7]。CyclinD1 是调控细胞由G1期进入S期，促进分裂增殖的关键周期蛋白，在生理状态下，细胞进人S期后CyclinD1迅速分解。若CyclinD1持续高表达，将导致G期缩短，提前进人S期，使细胞增殖失控，最终形成肿瘤。有研究发现，CyclinD1蛋白过度表达与结肠癌组织分化程度、淋巴结转移及Dukes分期明显相关，在结肠癌的发生、发展过程中起着重要的作用[8]。本实验发现，PA作用48 h后，各浓度组Pim1、Bcl2、CyclinD1的mRNA表达水平较空白对照组均明显降低，其中800 mg/L组三者表达显著下调。提示PA具有抑制结肠癌HT29细胞增殖及降低Pim1、Bcl2、CyclinD1 mRNA表达作用，且具有一定的时效性及量效关系，说明PA抑制细胞增殖机制可能与下调与细胞增殖密切相关的Pim1、Bcl2、CyclinD1表达有关。但原花青素是直接或/和间接作用于这些基因发挥期抑制大肠癌细胞的增殖，仍需进一步研究。

参考文献

[1]周坦洋，罗芙蓉，白彬葡萄籽原花青素生物药理活性的研究进展.哈尔滨医科大学学报，2012，46（1）：9496.

[2]Simona D， Alessandra C， Alessia P， et al Antiproliferative and apoptotic effects triggered by grape seed extract versus epigallocatechin and procyanidins on colon cancer cell lines. International Journal of Molecular Sciences， 2012， 13， 651664.

[3]Hsu CP， Lin YH， Cho CC， et al Mechanisms of grape seed procyanidininduced apoptosis in colorectal carcinoma cells. Anticancer Research，2009，29：283290.

[4]M Thomas， K LangeGrünweller， U Weirauch， et al The protooncogene Pim1 is a target of miR33a. Oncogene，2012，31：918928.

[5]Sun N， Meng Q， Tian A Expressions of the antiapoptotic genes Bag1 and Bcl2 in colon cancer and their relationship. Am J Surg， 2010， 200（3）： 341345.

[6]Venkat RK， Catalina SC， Chandrakumar S， et al Bax expression is a candidate prognostic and predictive marker of colorectal cancer. Journal of Gastrointestinal Oncology，2010， 1（2）：7689.

[7]Aho TL， Sandholm J， Peltola KJ， et al Pim1 kinase promotes inactivation of the proapoptotic Bad protein by phosphorylating it on the Ser112 gatekeeper site. FEBS Lett，2004，571（13）：4349.

[8]陈小贺，孟文格，张国军，等细胞周期相关蛋白CyclinD1、p16在大肠癌中的表达及其意义. 中国医药导刊，2011，13（6）：10381040.