时间：2022-09-03 03:43:49
【摘要】 目的：探讨糖皮质激素在抑郁模型大鼠中对海马脑源性神经营养因子（BDNF）基因选择性剪切的影响，为抑郁症的病因学研究和治疗提供理论基础。方法：选取SD雄性大鼠30只，随机分为对照组、高剂量组及低剂量组，每组10只，适应性饲养5 d，各组大鼠给药前均进行强迫游泳试验和敞箱试验。高低剂量组分别口服皮质酮（CORT）100 μg/mL和25 μg/mL 21 d，从第15天起CORT浓度降为原来的50%，第18天起降为原来的25%，对照组口服2.4%酒精溶液21 d。21 d后，各组大鼠均再次进行强迫游泳试验和敞箱试验，每周进行体重测量，之后在高低剂量组中选取其中一组制备成功的抑郁大鼠作为模型组，大鼠断头后提取海马组织进行分区，使用聚合酶链反应（PCR）对海马各区BDNF mRNA进行检测。结果：给药后，高低剂量组漂浮时间均较给药前增加，比较差异均有统计学意义（P
【关键词】 抑郁症； 糖皮质激素； 脑源性神经营养因子； 选择性剪切
【Abstract】 Objective：To explore the effect of glucocorticoid on the brain-derived neurotrophic factor （BDNF） gene in hippocampus of depression model rats，and to provide the theoretical basis for the etiology and treatment of depression.Method：A total of 30 male SD rats were randomly divided into the control group，high dose group and low dose group，each group had 10 rats，they were fed 5 d adaptive，the forced swimming test and open-field test were performed before administration in each group.The high and low dose group were respectively treated with oral corticosterone （CORT） 100 μg/mL and 25 μg/mL for 21 d，CORT concentration reduced to 50% of the original from 15 days，and it down to the original 25% from 18 days，the control group was treated with oral administration of 2.4% alcohol solution for 21 d. After 21 d，rats in each group were again carried on forced swimming test and exposure test and measured weight weekly，after this，for the high and low dose group，one group was selected to prepare a successful model of depression in rats and was selected as the model group.Hippocampal tissue were extracted partition，BDNF mRNA in hippocampal area were detected by using polymerase chain reaction （PCR）.Result：After administration，the floating time of the high and low dose group were higher than before administration，the differences were statistically significant（P
【Key words】 Depression； Glucocorticoid； Brain-derived neurotrophic factor （BDNF）； Alternative splicing
First-author’s address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.14.001
抑郁症（major depressive disorder，MDD）是一种以情绪低落、缺失、焦虑、思维迟缓和食欲体重下降等为特点的精神疾病[1]。目前临床认为，抑郁症主要由周围生活中应激性事件的刺激，致使体内糖皮质激素持续增多，大脑中情绪相关回路中神经递质失衡引起[3]。本文采取慢性口服糖皮质激素的方式制备大鼠抑郁模型。
脑源性神经营养因子（BDNF）在海马脑区广泛分布，对神经元的再生与修复起着重要作用，抑郁会导致该蛋白表达降低[4-5]。因此，当抑郁发生时，BDNF的基因转录表达非常重要。BDNF基因包含多个不同的启动子控制着不同的非编码区和1个编码区，不同的非编码区与编码区组合形成不同的转录本，随着环境不同或者条件刺激不同，海马神经元包含不同启动子的BDNF mRNA表达出现差异，进而影响BDNF蛋白的表达。本文旨在观察抑郁模型大鼠海马脑区包含不同启动子的BDNF mRNA表达的差异，即选择性剪切的影响，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料 SD雄性大鼠30只，由山西医科大学动物实验中心提供；FST-100睡眠剥夺与强迫游泳实验系统（成都泰盟软件有限公司），OFT-100开场活动实验箱及视频分析系统（成都泰盟软件有限公司），Corticosterone（皮质甾酮）Aladdin industrial corporation，GE9612T-S基因扩增仪（杭州柏恒科技有限公司），LineGene 9640荧光定量PCR仪（杭州博日科技有限公司），总RNA抽提纯化试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司），Real Time PCR反转录试剂盒（TAKARA），实时荧光定量PCR反应试剂盒（TAKARA），PCR引物均由Invitrogen（上海）有限公司合成。
1.2 实验方法 将30只大鼠随机分为对照组、高剂量组及低剂量组，每组10只，随机分于15笼，称取体重，2只/笼。所有大鼠均置于12 h昼夜循环的条件下自由摄食饮水，适应性饲养5 d。各组大鼠给药前均进行强迫游泳试验和敞箱试验。高低剂量组分别口服皮质酮（CORT）100 μg/mL和25 ?g/mL 21 d，从第15天起CORT浓度降为原来的50%，第18天起降为原来的25%，对照组口服2.4%酒精溶液21 d。21 d后，各组大鼠均再次进行强迫游泳试验和敞箱试验，每周进行体重测量，之后在高低剂量组中选取其中一组制备成功的抑郁模型大鼠，对该组大鼠进行断头快速提取海马组织进行分区，使用聚合酶链反应（PCR）对海马各区BDNF mRNA进行检测。
1.3 配药方法 （1）高剂量组（100 μg/mL）：称取CORT 60 mg，溶于14.4 mL 100%纯酒精，混匀后，用饮用水稀释至2.4%；（2）低剂量组（25 μg/mL）：称取15 mg CORT粉末，溶于14.4 mL 100%纯酒精，混匀后，用饮用水稀释至2.4%；对照组：量取14.4 mL 100%纯酒精，用饮用水稀释至2.4%[6]。将各组配好的600 mL溶液分别置于5个水瓶
（120 mL/瓶），于每日上午9时给予大鼠口服，共21 d。
1.4 评价指标
1.4.1 强迫游泳实验 强迫游泳装置尺寸直径20 cm、高50 cm，置于安静的房间。装置内水深度为35 cm，水温23～25 ℃。将大鼠单独放入游泳装置，观察记录5min内的不动时间，全过程使用摄像头记录。游泳期间，主要观察实验鼠在水中的挣扎和漂浮行为，挣扎：大鼠的四肢激烈运动，并同时伴随前肢伸出水面；漂浮：大鼠四肢没有运动或仅有后肢轻微的运动而漂浮在水面上。采用大鼠的不动时间作为抑郁严重程度的评价指标。
1.4.2 敞箱实验 时间安排在上午进行，以减少昼夜节律导致的误差。实验在安静环境下进行，将动物放在箱底中心，观察5 min内大鼠后肢站立次数、水平运动总距离，在四周与中心所待的时间。水平活动反映动物的活动度，一定程度上反映动物的探究行为，直立活动反映动物对新异环境探究程度。
1.4.3 荧光定量PCR 经过口服高低剂量皮质酮均可以制备出较为理想的抑郁大鼠模型，因此，最终选取高剂量组作为抑郁模型组进行断头快速提取海马组织且进行分区。Total RNA的提取：称取分区后的大鼠海马组织25 mg左右在液氮中研磨成粉末，加入450 ?L Buffer Rlysis-AG，放置2 min，将液体全部转移至收集管中，震荡2 min，放置
3 min。12 000 rpm 4 ℃离心3 min，将上清移至离心管中。加入1/2体积的无水乙醇，混匀。将溶液转移至吸附柱中，放置1 min，室温12 000 rpm 离心1 min，离心完毕后，倒掉收集管中废液，加入
500 ?L GT Solution，静置1 min，室温10 000 rpm
离心1 min，加入500 ?L NT Solution，静置2 min，
室温10 000 rpm 离心1 min，将吸附柱放回收集管中，室温12 000 rpm 离心2 min。将吸附柱放入RNase-free的1.5 mL离心管中，在吸附膜中央加入20 ?L DEPC-treated水，静置2 min，室温
12 000 rpm 离心2 min，最后将所得到的RNA溶液进行反转录。以反转录得到的cDNA为模板，大鼠Actin为内参，使用SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒，用荧光定量PCR仪进行Real Time PCR反应操作，反应结束后，Ct值可自动生成，荧光定量采用相对定量法，目的基因的相对表达量采用2-Ct法进行计算。检测高剂量的模型组和对照组大鼠海马各区BDNF不同mRNA转录本的表达。
1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0 统计学软件对数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，两两比较采用SNK法，自身给药前后数据比较采用配对t检验，以P
2 结果
2.1 各组强迫游泳实验比较 高剂量组给药前后漂浮时间分别为（167.63±7.46）s和（237.19±8.62）s，低剂量组给药前后漂浮时间分别为（177.12±7.55）s和（235.18±9.33）s，对照组给药前后漂浮时间分别为（178.86±8.23）s和（178.38±5.86）s，给药后，高低剂量组漂浮时间均较给药前增加，比较差异均有统计学意义（P
2.2 各组敞箱实验比较 给药后，高低剂量组运动总距离、站立次数及中心时间均较给药前降低，比较差异均有统计学意义（P
2.3 大鼠体重变化比较 高剂量组体重增长值始终低于对照组，低剂量组前2周与对照组比较无明显差异，但第3周体重增长值减小，明显低于对照组，比较差异有统计学意义（P
2.4 各组BDNF mRNA转录本表达量比较 除BDNF mRNAⅥ CA1区和BDNF mRNAⅧ CA3区外，BDNF mRNAⅡa，BDNF mRNAⅢ，BDNF mRNAⅥ，BDNF mRNAⅦ，BDNF mRNAⅧ的转录表达量模型组均较对照组降低，见表3和图4。
3 讨论
在上述实验中，高低剂量组大鼠均出现抑郁样表现。敞箱实验中大鼠在角落时间增加，水平运动距离缩短，站立次数降低，这都反应出模型组大鼠的焦虑程度增高。在强迫游泳实验中，大鼠的漂浮时间增加，表现出绝望和无助，同时体重增长缓慢。这些表现均与抑郁症状相同，表明本实验中抑郁模型是成功的。
大鼠海马脑区BDNF与TrkB受体结合后可启动细胞内信号转导途径如磷酸脂酶Cr（PLC）、Ras-MAPK激酶途径、PI3激酶途径等，从而产生相应分子对神经元起保护、促进再生作用[7-10]。慢性口服糖皮质激素导致抑郁发生时，整个通路发生改变导致BDNF表达减少，海马神经元萎缩受损，尤其是DG区神经元数目减少，整个情绪神经网络发生变化，最终影响情绪精神。由于BDNF基因的表达发生变化，导致调控蛋白水平的改变。BDNF基因由不同启动子控制着不同的非编码区，而不同的非编码区与编码区组合形成不同的异构体。在成年大鼠，包含外显子Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅷ的mRNA在全身分布广泛，包含外显子Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的mRNA主要在神经系统表达，包含外显子Ⅶ，ⅨA的mRNA主要在海马脑区表达。在大鼠CA3区和齿状回的神经元，包含外显子Ⅰ和Ⅱ的mRNA表达比CA1区的强烈，情境学习可以增强小鼠CA1区包含外显子Ⅰ和Ⅵ的BDNFmRNA表达，恐惧刺激主要引起包含外显子Ⅳ的mRNA表达[11-12]。在海马中，齿状回DG区神经元增殖最快，不断更新，新生神经元替挥成熟神经元的作用，而CA1与CA3区则不同，神经元数量及新生能力明显低于DG区[11]。BDNF的表达受多种因素影响，在细胞内，cAMP激活蛋白激酶，并将CREB磷酸化上调cAMP-CREB通路[13]。增加海马BDNF mRNA转录表达，BDNF蛋白的合成[8，10]。但是，糖皮质激素长期作用，致使BDNF mRNAⅡa，BDNF mRNAⅢ，BDNF mRNAⅥ，BDNF mRNAⅦ，BDNF mRNAⅧ的转录表达量明显降低。BDNF蛋白的表达量随之降低[14-17]。
表观遗传对基因的转录表达同样有重要的影响，常见的表观遗传机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰及RNA介导基因转录等，它们彼此相互作用，通过控制基因表达的时间和空间特异性精确地调节着基因组功能[18]。在多种形式中，组蛋白的共价修饰占有重要地位，乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化和SUMO化等修饰与基因的表达调控密切关联。特定DNA位点或区域各种组蛋白修饰方式共同构成了“组蛋白密码”，具有调控相关基因转录活化或抑制的功能[19]。组蛋白乙酰化能选择性开放某些基因的转录，增强其表达水平。而组蛋白甲基化既可抑制也可增强基因表达[20]。
本文通过强迫游泳实验、敞箱实验研究发现，连续口服糖皮质激素导致抑郁发生后，大鼠海马脑区BDNF mRNA的选择性剪切变化，即BDNF mRNAⅡa，BDNF mRNAⅢ，BDNF mRNAⅥ，BDNF mRNAⅦ，BDNF mRNAⅧ的转录表达量明显降低。这一变化也可能由于表观遗传对BDNF基因的修饰影响所导致，这还需要更深入的研究。
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（收稿日期：2016-03-14） （本文编辑：李颖）