含砷中药复方青黄散治疗骨髓增生异常综合征的克隆选择性与砷体内效应的相关性研究

摘要：目的 探讨含砷中药复方青黄散治疗骨髓增生异常综合征（MDS）的克隆选择性与砷体内效应的相关性。方法 对接受口服青黄散（每日雄黄0.16 g）治疗的MDS患者40例（治疗组）进行疗效评价，分析MDS患者口服青黄散后血砷浓度和线粒体膜电位（Ψm），并与未服用青黄散或其他砷制剂的MDS患者（未治疗组）以及正常人（健康对照组）进行比较。结果 治疗组总有效率为75.0%（30/40）。伴随正常克隆与+8异常克隆患者的疗效明显好于其他异常克隆类型（P

关键词：骨髓增生异常综合征；青黄散；雄黄；砷；克隆选择性；线粒体膜电位

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.06.004

中图分类号：R259.513 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）06-0008-03

本院血液科应用含砷中药复方青黄散治疗恶性血液病已有50余年的历史[1-2]。目前，国内广泛应用砷制剂治疗恶性血液病，取得令人满意的效果[3]。砷在体内持续发挥作用，需要维持有效的血砷浓度。巯基是砷剂发挥作用的重要化学靶点，而线粒体是对砷剂作用最敏感的细胞器，砷剂与巯基结合后，导致线粒体通透性转运孔道开放，线粒体跨膜电位（membrane potentials，ψm）下降或消失，诱导细胞凋亡[4]。

近年来，我们应用小剂量青黄散治疗骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）亦取得了很好的疗效[1，5]。MDS是一组起源于造血干（祖）细胞的克隆性异质性疾患，高风险向白血病转化[6]。细胞克隆类型在MDS治疗选择与预后判断中具有独立的意义[7-8]。我们的既往研究显示，青黄散治疗MDS的疗效与MDS的克隆类型有关，正常核型与+8克隆异常者对青黄散反应较好，而其他克隆异常者反应较差[9-10]。本研究通过测定不同克隆类型的MDS患者治疗前后血液砷的含量、线粒体ψm的改变，分析青黄散在不同克隆类型MDS患者的体内效应状况，探讨含砷中药复方青黄散治疗MDS克隆选择性的可能机理，为MDS的遗传学分型治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2010年2月-2012年4月于本院接受青黄散治疗的MDS患者40例，为治疗组，男性23例，女性17例，年龄9～81岁，平均（42.2±18.1）岁。30例未接受青黄散治疗的MDS患者作为未治疗组。10例正常人为本院职工，作为健康对照组。

1.2 治疗方法

治疗组：给予青黄散胶囊[本院制剂室提供，每粒含雄黄（As2S2）0.16 g]1粒/d，晚饭后立即服用。所有MDS患者加用补肾健脾中药汤剂（熟地黄30 g，山药10 g，山萸肉10 g，茯苓10 g，泽泻10 g，补骨脂15 g，菟丝子15 g，桑葚30 g，制何首乌20 g，党参20 g，炒白术10 g等），每日1剂，水煎，分2次服。就诊前服用雄激素治疗者仍继续服用，司坦唑醇2 mg/次，或十一酸睾酮40 mg/次，2～3次/d，口服，葡醛内酯100 mg/次， 3次/d，口服。其他西药如环孢菌素A、沙利度胺、促红细胞生成素等入组前均停用。若血红蛋白

未治疗组：MDS初诊或就诊前服用雄激素或/和环孢菌素A，不使用青黄散以及其他含砷制剂。

1.3 疗效标准

参照2000年国际工作组指定的MDS疗效标准[11]，分为有效（包括完全缓解、部分缓解、血液学进步）和无效（治疗失败）。

1.4 砷浓度检测

血样标本采集时间在服药后10～12 h，采用高效液相色谱（HPLC）与电耦合等离子体质谱（ICP-MS）联用技术对全血及血浆进行砷浓度的检测，检出限：总砷0.03 ?g/L。

1.5 线粒体膜电位测定

取EDTA抗凝骨髓液2 mL，分离单个核细胞，取1×106个细胞，按照JC-1试剂盒说明，标记JC-1荧光，用流式细胞仪测定。FL1（绿色荧光）的PMT值为525 BP，FL2（红色荧光）的PMT值为575 BP。用FL2/FL1的荧光强度比值反映线粒体Ψm。

1.6 克隆类型的确定

骨髓细胞经24～48 h培养，G-显带，根据《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN，2005）》判定核型异常[12]。

1.7 异常克隆类型鉴定

主要异常克隆应用荧光原位技术（FISH）进行鉴定，荧光探针（CEP8、D5S23-EGR1、D7S522-CEP7以及D20S108）均为Vysis产品，并采用Hybrite变性/杂交系统。应用Nikon全自动显微镜及AI全自动FISH自动分析系统分析荧光信号。每个样本计数200个以上间期细胞。

1.8 统计学方法

采用SPSS18.0统计软件进行分析。计量资料用―x±s表示，各期血砷水平之间的比较，两样本均数比较用t检验，多样本均数比较采用方差分析法。血砷浓度和服药时间的相关性，用相关性分析和线性回归分析。全部统计方法均采用双侧检验。P

2 结果

2.1 青黄散总体疗效及其克隆选择性

治疗组40例中，有效30例（75.0%），包括完全缓解10例（25.0%）、部分缓解4例（10.0%）、血液学进步16例（40.0%），无效10例（25.0%），有效率为75.0%。

经过常规染色体分析确定，并经过FISH鉴定，40例治疗组患者中，正常克隆24例，+8异常克隆6例，其他异常克隆10例，异常克隆检出率40%。将治疗组患者按照克隆类型分为2组，A组为正常核型和+8克隆异常，共30例，有效24例；B组为其他异常克隆类型，共10例，有效6例。A组疗效优于B组（P

2.2 青黄散克隆选择性与砷体内效应相关性

2.2.1 青黄散治疗后血砷浓度 全血、血浆砷浓度测定结果显示，未治疗组与健康对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。治疗组全血及血浆砷浓度明显高于未治疗组（P

2.2.2 青黄散服药时间与血砷浓度的相关性 对治疗组患者的服药时间长短和全血砷浓度、血浆砷浓度进行相关性分析，两变量的皮尔逊相关系数分别为0.061、-0.195，双侧检验概率P值分别为0.703、0.223，差异无统计学意义。提示口服青黄散时间的长短和血砷浓度没有明显相关性。见图1。

2.2.3 青黄散疗效与血砷浓度的关系 青黄散治疗有效患者的全血砷浓度明显高于治疗失败的患者（P0.05）。提示MDS患者服用青黄散后，砷进入血液细胞内发挥作用。见表2。

2.2.4 青黄散的克隆选择性与全血砷浓度的相关性 40例治疗组患者，以疗效好的正常核型和+8异常患者为A组，疗效较差的其他异常核型患者为B组，2组全血砷浓度差异无统计学意义（P>0.05），提示青黄散治疗MDS对克隆的选择性与血砷浓度没有相关性。见表3。

2.2.5 青黄散治疗后骨髓细胞线粒体膜电位变化 治疗组28例患者检测了骨髓单个核细胞线粒体Ψm，为10.83%±8.47%，未治疗组30例患者的线粒体Ψm为10.61%±9.31%。2组比较，线粒体Ψm的变化差异无统计学意义（P>0.05）。提示口服青黄散后MDS患者的线粒体Ψm没有明显变化。青黄散治疗前后线粒体Ψm情况见图2。

图2 青黄散治疗前后线粒体Ψm的变化

2.2.6 青黄散治疗后线粒体膜电位与血砷浓度的相关性 对治疗组28例患者的线粒体Ψm与血砷浓度的相关性进行了分析，结果显示，相关系数为-0.262，P=0.89，提示MDS患者口服青黄散后的线粒体Ψm与全血砷浓度没有相关性。见图3。

3 讨论

3.1 骨髓增生异常综合征克隆类型以及对治疗方法的选择性

MDS是一组起源于造血干（祖）细胞的克隆性异质性疾患，大约40%～60%的MDS患者具有染色体异常克隆，而大约50%的患者为正常核型。本组40例患者中，16例患者伴随染色体克隆异常，异常克隆发生率为40%，其中+8克隆是MDS最常见的染色体异常，与文献[13]以及我们的既往报道[9]一致。

遗传学分型是一种能反映MDS疾病本质的分型方法[14]，细胞克隆类型在MDS治疗选择与预后判断中具有独立的意义[7-8]。不同治疗方法对不同克隆类型MDS患者的疗效差异明显，如+8核型患者对免疫抑制剂反应较好、免疫调节剂已成为5q-核型患者的首选药物、细胞因子适宜于正常核型患者等，表明MDS不同克隆类型对治疗方法具有选择性[8]。

3.2 砷制剂在骨髓增生异常综合征治疗中的应用及体内效应

砷制剂包括砒霜提取物三氧化二砷（As2O3）以及雄黄（As2S2，As4S4）已在国内外广泛应用于MDS的治疗，无论是As2O3单药还是联合用药、雄黄单药及其复方在MDS治疗中具有独特的地位，安全有效[3，5]。

砷在体内持续发挥作用，需要维持有效的血药浓度。正常人全血砷水平低于5.0 ?g/L[4]。雄黄中As2S2含量大于90%，在水中溶解度很低，少量可被人体吸收。本组患者治疗后全血砷含量明显高于未治疗患者（P

砷在细胞内发挥作用最敏感的细胞器是线粒体，重要化学靶点是巯基[4]。砷与巯基结合后，线粒体通透性转运孔道开放，线粒体跨膜电位下降或消失，导致细胞凋亡级联反应，一旦线粒体崩溃，则细胞凋亡不可逆转[4]。本组患者经青黄散治疗后线粒体Ψm没有明显变化（P>0.05），提示青黄散每日1粒（含雄黄0.16 g）不会破坏细胞线粒体跨膜电位，也不引起细胞凋亡。

3.3 青黄散治疗骨髓增生异常综合征的克隆选择性及其与砷体内效应的相关性

我们既往的临床研究显示，青黄散治疗MDS的疗效与MDS的克隆类型有关，伴随正常核型与+8核型细胞遗传学异常者对青黄散反应较好，而伴随其他异常者对青黄散反应较差，提示青黄散治疗MDS具有克隆选择性[1，9-10]。本组治疗中，正常核型与+8克隆异常的患者有效率（80.0%）明显高于其他异常克隆类型的患者（60.0%），进一步证实了青黄散治疗MDS具有克隆选择性。

本组患者服用青黄散后血砷浓度分析显示，疗效好的正常核型和+8异常克隆患者与疗效较差的其他异常核型患者之间，血砷浓度没有明显差别（P>0.05），