硫磺熏蒸金银花中断马钱子酸亚硫酸衍生物产生的机制探讨

[摘要]为了探讨硫磺熏蒸金银花中断马钱子酸亚硫酸衍生物的生成机制，该研究采用柱色谱技术从未硫熏金银花中目标性制备分离了断马钱子酸以进行后续模拟反应，断马钱子酸在有水条件下与二氧化硫反应生成了其亚硫酸衍生物，反应机制可能涉及了断马钱子酸的酯化反应或者是酸化开环后亚硫酸根对羰基的加成反应。该研究为支持硫磺熏蒸导致金银花中断马钱子酸转变成其亚硫酸衍生物提供了实验依据。

[关键词]硫磺熏蒸；金银花；断马钱子酸

金银花为常用大宗中药材，来源于忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb. 的干燥花蕾或待初开的花，自1963年为历版《中国药典》所收载。金银花具有清热解毒，疏散风热之功效，用于痈肿疔疮，喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温病发热等[1]。其化学成分包括挥发油、酚酸（主要为绿原酸及其衍生物）、环烯醚萜（断马钱子酸、马钱苷、当药苷及其衍生物）和黄酮类（芦丁、木犀草苷等）。现代药理研究表明金银花具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、增强免疫力、解热抗炎和利胆保肝等作用[2]。传统的产地加工方法有晒干和阴干，现代加工方法有烘干、水蒸气干燥、热风干燥以及热风-微波联用等，1995年版《中国药典》曾收载过硫磺熏蒸的处理方法，在2000年版之后的《中国药典》均取缔了该产地加工方法，然而，在某些主产区，有时仍会采用硫磺熏蒸以获得良好的外观色泽和防止虫蛀。前期研究表明硫磺熏蒸能够导致金银花中环烯醚萜类主成分断马钱子酸1的含量降低，同时生成其亚硫酸衍生物2～4[3]，见图1。断马钱子酸是一种分子结构中具有半缩醛羟基的环烯醚萜类成分，为金银花含有的环烯醚萜类物质中的主要成分[4]，含量远远高于马钱苷和当药苷及其二聚产物，其含量的变化有可能会引起金银花与环烯醚萜类成分相关的药理活性的改变，譬如抗炎、抗病毒、保肝利胆等。为了进一步验证硫熏金银花中断马钱子酸亚硫酸衍生物的生成机制，该研究采用柱色谱技术从未熏金银花中目标性制备断马钱子酸作为反应底物，将其在有水条件下与SO2反应，TLC和HPLC监测反应进程，基于LC-MS提供的质谱信息，与文献数据比对，鉴定生成的化合物结构。

1材料

Shimadzu LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津）、Agilent 1200-6130系列液相色谱-质谱联用仪（Agilent Technologies）、大容量冷冻离心机（DL-6MB， 长沙英泰仪器有限责任公司）、SIGMA 1-14小型离心机（Germany）、EYELA N-1100旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）、裕华HH-S型水浴锅（巩义市裕华仪器有限责任公司），HZ85-1型磁力搅拌器（北京中兴伟业仪器有限公司）、三口瓶、双连球等。

色谱甲醇、色谱乙腈（Fisher， USA），娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司），其他试剂均为分析纯。

新鲜的金银花于2012年5月采自山东济南，经中国中医科学院中药研究所王智民研究员鉴定为忍冬科植物忍冬L. japonica的花蕾。晒干样品：新鲜金银花摊开晾晒于太阳下至干燥即得；硫磺熏蒸样品：新鲜金银花摊开放于支架上的透气金属网筛中（不宜太厚），支架下端用铁质器具装入一定量硫磺粉末，点燃硫磺粉末出现蓝紫色火焰，将整个装置用塑料布密封，使硫磺黄色烟雾充满装置，熏制过夜，熏制后的金银花晾于阴凉处，阴干即得。

2方法与结果

2.1断马钱子酸的分离制备

前期研究表明，晒干金银花样品中断马钱子酸的含量较高[3]，因此选择晒干样品进行该化合物的目标性分离制备。干燥的金银花样品（粉碎，311 g）用17 L 50%乙醇渗漉提取，渗漉液回收溶剂至无醇味（约2 300 mL），离心（3 500 r・min-1，20 min），上清液（约2 100 mL）上HPD-100大孔吸附树脂柱，依次用5倍柱体积的水，10%，20%，30%，40%，95%乙醇洗脱，TLC和HPLC进行流分检查，20%，30%乙醇洗脱部分富集断马钱子酸，合并后得10.3 g固体粉末，上硅胶柱（300～400目，氯仿-甲醇-水15∶4∶0.4）进行粗分，ODS柱纯化（10%甲醇洗脱），得到单体化合物（277 mg）。经HPLC面积归一化法检测其纯度为94%；经HPLC比对保留时间，在线紫外吸收以及质谱数据，确证该化合物为断马钱子酸。晒干金银花50%甲醇超声提取液和断马钱子酸在同一色谱条件下的HPLC图见图2。Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为1.4 %甲酸水（A）和乙腈（B），梯度洗脱（0～20 min，3%～8% B；20～45 min，8%～15% B；45～60 min，15%～24% B；60～70 min，24%～40% B），检测波长254 nm，流速 1 mL・min-1，进样量10 μL，柱温30 ℃。

2.2断马钱子酸在有水条件下与SO2反应

新鲜的金银花经硫磺熏蒸后断马钱子酸1大部分被破坏，生成其亚硫酸衍生物2～4[3]，推测是断马钱子酸结构中的半缩醛基团与熏蒸过程中硫磺燃烧产生的SO2在有水的条件下发生反应所致；同时通过2007，2012年采集制备的硫磺熏蒸金银花样品的HPLC图比对发现，在不同批次样品中化合物2～4的含量比例不同[3，5]，推测是熏蒸过程中断马钱子酸与SO2接触程度不同。因此，开展了以下实验进行验证。

2.2.1 反应1 Na2S2O3溶液（3 mol・L-1）与H2SO4（3 mol・L-1）水浴40 ℃反应生成的SO2气体通入装有20 mL水的三角瓶中，待检测到水溶液呈酸性（pH=1）时加入断马钱子酸固体粉末20 mg，磁力搅拌器不断搅拌，使之混合均匀，密封保温放置15 h，回收溶剂至干，甲醇复溶，按照2.1项下的HPLC条件进行检测，产生了化合物2，3，见图3。

2.2.2 反应2 在断马钱子酸水溶液（1 g・L-1）中通入由Na2S2O3溶液（1 mol・L-1）与H2SO4（3 mol・L-1）水浴40 ℃生成的SO2气体，每隔1 h取样200 μL，按照2.1项下的HPLC条件进行检测，反应底物断马钱子酸与产物的HPLC图见图4，两者峰面积随时间的变化见图5，5 h后断马钱子酸完全转化成为化合物2。

2.2.3 反应3 在断马钱子酸水溶液（3 g・L-1）中通入由Na2S2O3（固体）与H2SO4（浓）水浴40 ℃生成的SO2气体，每隔2 min取样200 μL，按照2.1项下的HPLC条件进行检测，反应底物断马钱子酸与反应产物的HPLC图见图6，两者峰面积随时间的变化见图7，2 min后断马钱子酸完全转化成为化合物2。

2.2.4 亚硫酸衍生物的HPLC和LC-MS确认 基于相同色谱条件下HPLC-DAD分析提供的保留时间和在线紫外全波长光谱，与文献比对，反应1生成了亚硫酸衍生物2，3。由于化合物2非常不稳定，在回收去除溶剂的过程中会转变为脱SO2的产物（tR=46～48 min），反应2和3采用反应后直接进行HPLC分析，只检测到化合物2生成。除了保留时间和在线紫外光谱，负离子模式下的液质联用分析也提供了化合物2的准分子离子峰455[M-H]-和911[2M-H]-以及碎片离子峰373[M-SO2-H2O-H]-，与文献数据一致[3]。

3讨论

断马钱子酸是一种分子结构中具有半缩醛羟基的环烯醚萜类成分，曾经从忍冬科金银花L. japonica Thunb.、蓝果忍冬L. coerulea Linn.和长白忍冬L. ruprechtiana Regel等植物中分离得到，在不同批次晒干和硫熏金银花中的质量分数分别为0.79%～2.63%，0.20%～1.25%（未发表数据），为金银花中环烯醚萜类物质中的主要成分，其含量的变化有可能会引起金银花与环烯醚萜类成分相关的药理活性的改变，比如抗炎、抗病毒、保肝利胆等。由于该物质水溶性强，缺少市售对照品的供应，本研究探索了从晒干金银花中富集、制备该成分的工艺流程，能够实现快速、批量制备该物质，为后续反应进行提供了物质保障。

Braverman等报道了硫熏食品中普遍存在SO2与糖类物质的反应，与开链醛糖反应涉及了亚硫酸根对羰基的加成反应，而与环状半缩醛糖类的反应涉及酸脱羟基醇脱氢的酯化反应[6-7]。在2.2.1项中，断马钱子酸粉末加入到SO2的水溶液中，固体粉末在溶解的过程中即与亚硫酸反应，产生了化合物2和3，说明此过程既有半缩醛羟基的酯化反应，也有断马钱子酸先水解后产生开链醛糖中间体，然后涉及亚硫酸根对羰基的加成反应，推测的反应历程见图8。2.2.2和2.2.3项表明，若将断马钱子酸先溶于水，然后不间断通入SO2气体，只有化合物2产生，说明断马钱子酸在酸性环境中不稳定，易发生水解，内酯环开裂，与亚硫酸的反应只涉及了上述第二种反应历程；并且反应完全受控于SO2气体的通入速度和量。硫代硫酸钠与稀硫酸反应时，SO2产生缓慢，断马钱子酸与亚硫酸反应完全需经历5 h；硫代硫酸钠与浓硫酸反应时，SO2产生迅速，断马钱子酸与亚硫酸反应完全仅需要2 min。

在断马钱子酸与亚硫酸的反应中，未检测到硫熏金银花中另外一个主要衍生物4的生成，推测其可能的原因有二：①新鲜的金银花在硫磺熏蒸过程中，复杂的组织环境和丰富的酶系统使化合物2或

3进一步甲酯化产生了化合物4，而该研究采用断马钱子苷与SO2水溶液反应，不能完全反映硫磺熏蒸金银花的复杂过程；②金银花中含具有开链醛基的化合物开链马钱子苷，它在硫熏过程中与亚硫酸发生加成反应，产生化合物4。

新鲜的金银花含水量较大，经过硫磺熏蒸而富含亚硫酸，其中的主要环烯醚萜类成分断马钱子酸在酸性环境中不稳定，与亚硫酸反应生成其相应的衍生物，该研究为揭示上述硫磺熏蒸机制提供了进一步的实验依据。

近年来越来越多的研究表明硫磺熏蒸不仅导致二氧化硫残留量超标，而且能够改变其中的化学成分及其生物活性，比如白芍熏蒸导致芍药苷和苯甲酰芍药苷含量降低，生成其相应的亚硫酸衍生物[8-9]，生晒参熏蒸导致人参皂苷含量降低，生成其亚硫酸钠衍生物[10]，白芷熏蒸导致其中取代的呋喃香豆素水解成苷元[11]，熏蒸导致黄酮苷水解成其相应苷元[12]等。本研究为开展上述其他中药硫磺熏蒸导致化学变化的反应机制研究提供了参考。

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Investigation on formation mechanism of secologanic acid sulfonates in

sulfur-fumigated buds of Lonicera japonica

GUO Ai-li 1，2，3， GAO Hui-min 2，3*， CHEN Liang-mian 2，3， ZHANG Qi-wei 2，3， WANG Zhi-min 2，3*

（1.School of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing 100069， China；

2.Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

3.National Engineering Laboratory of Quality Control Technology of Chinese Herbal Medicines， Beijing 100700， China）

[Abstract] To investigate formation mechanism of secologanic acid sulfonates in sulfur-fumigated buds of Lonicera japonica， secologanic acid was enriched and purified from the sun-dried buds of L. japonica by various column chromatography on macroporus resin HPD-100， silica gel and ODS. The stimulation experiments of sulfur-fumigation process were carried out using secologanic acid reacted with SO2 in the aqueous solution. The reaction mechanism could be involved in the esterification or addition reaction. The present investigation provides substantial evidences for interpreting formation pathway of secologanic acid sulfonates in sulfur-fumigated buds of L. japonica.

[Key words] sulfur-fumigation； Lonicera japonica； secologanic acid

doi：10.4268/cjcmm20140919