高胆固醇血症患者外周血内皮祖细胞的变化及丹参的保护作用

张怀勤　李海鹰　杨鹏麟　唐疾飞

摘　要：目的：观察丹参对高胆固醇血症患者内皮祖细胞(endotlial progeIlitor cells，EPCs)的保护作用。方法：年龄性别匹配的健康志愿者及高胆固醇血症患者各6例入选研究，各取空腹外周血20mL，采用密度梯度离心法分离单个核细胞，贴壁选择法行EPcs培养，以健康志愿者为对照组，各高胆固醇血症患者血样一分为二，分别为高胆固醇组及丹参组，丹参组培养时另添加复方丹参注射液10μg/mL，采用流式细胞术、倒置显微镜、MIT法、Boyden小室等分别观察各组EPC8数量、集落形成能力、增殖能力、黏附能力及迁移能力。结果：高胆固醇血症患者外周血EPCs数量较对照组显著下降[(6.13±0.84)vs(24.53±3.67)，P＜0.01]，且其克隆形成能力、增殖能力、黏附能力及迁移能力也显著降低，培养时添加复方丹参注射液使丹参组克隆形成能力、增殖能力、黏附能力及迁移能力较高胆固醇组显著提高，但低于对照组，其中黏附能力及迁移能力虽仍较对照组低。但无统计学差异(P＞0.05)。结论：高胆固醇血症患者外周血内皮祖细胞数量下降，功能受损，复方丹参注射液对高胆固醇血症患者外周血培养的内皮祖细胞功能有保护作用。

关键词：丹参；内皮祖细胞；细胞培养；高胆固醇血症

随着内皮祖细胞(endotllelial progenitor cells，EPCs)的研究逐步深入，EPCs和动脉粥样硬化、冠心病的关系引起研究者极大兴趣。EPCs促进血管新生，参与体内血管内膜损伤的修复过程，在动脉粥样硬化早期预防中起重要作用。高胆固醇血症是动脉粥样硬化、冠心病的重要危险因素。研究发现高胆固醇血症患者外周血EPCs数量减少，功能受损。因此，寻找有效药物动员高胆固醇血症患者体内EPCs、增加外周血EPCs数量并改善其功能成为动脉粥样硬化、冠心病防治的一个研究新方向。丹参具有保护内皮细胞，改善内皮功能的作用。丹参对于与内皮细胞同一谱系的EPCs是否有保护作用呢?本实验观察高胆固醇血症患者外周血内皮祖细胞的变化及丹参的作用，以进一步明确丹参的作用机制。

1　材料

纤维连接蛋白购自Boche公司，VEGF购自PeproTechEC公司，Ⅷ因子相关抗原免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程公司，MTr购自华美生物工程公司PE-CD34购自CALTAG LABORATORIES，FITC-VE-Cadherin购自Bender systemTM公司，PE-VEGFR-2及FITC-ACl33购自R&D systems，胎牛血清、胰酶、M199、ECGS、Hank's液、PBS均购自GIBCO公司，DiI-ac-LDL购自Molecularprobe公司，Boyden小室为江苏海门麒麟医用仪器厂生产，复方丹参注射液为贵州神奇制药生产，其余为市售试剂。

2 方法

2．1 实验分组健康志愿者及高胆固醇血症患者各6例入选研究，高胆固醇血症患者的诊断参照1997年中华心血管病学分会制订的《血脂异常防治建议》，两组年龄、性别匹配。剔除外伤、溃疡、视网膜病、近期外科手术、炎症、肿瘤等影响内皮祖细胞疾病的患者，近3个月无急性心肌梗死、心绞痛发生。各取空腹外周血20mL，采用密度梯度离心法分离单个核细胞，以健康志愿者为对照组，各高胆固醇血症患者血样一分为二，分别为高胆固醇组及丹参组。

2．2 人外周血EPCs培养，将分离到的单个核细胞，以5×106/cm2密度接种于包被有纤维连接蛋白的24孔培养皿中，每组每份血样各6mm，每皿加入lmL包含有20％胎牛血清、青霉素(100U/mL)及链霉素(100U/mL)的M199，丹参组每皿添加复方丹参注射液101μg/mL，其余各组添加等量培养液，置37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养。3天后，洗去未贴壁细胞，如前添加培养液继续培养待用。

2．3 EPCs鉴定培养细胞以0.25％胰酶消化后，制成1×106/mL的单个细胞悬液，加入荧光标记的CD34、VE-Cadherin、VEGFR-2或ACl33 10μL(1mg/mL)，流式细胞仪分析细胞CD34、VE-Cadherin、VEGFR-2及ACl33的表达。为验证培养细胞吞噬DiI-ac-LDL，将DiI-ac-LDL以2.4μg/mL的终剂量加入培养液，与细胞避光共孵育4h，洗去培养液后荧光显微镜下观察细胞荧光。以不加DiI-ac-LDL的同批培养细胞作空白对照。阴性对照采用GSC7901(胃癌细胞株)。培养细胞Ⅷ因子相关抗原的检测采用免疫组化法，空白对照不加一抗，阴性对照采用GSC7901。

2．4 外周血EPCs数量检测采用本实验室方法，取各组分离的外周血单个核细胞各1/10，制成1×106/mL的单个细胞悬液，加入荧光标记的CD34及ACl33各10μL(1mg/mL)，流式细胞仪分析细胞CD弘及ACl33的表达，以双阳性细胞为EPCs，QIleBt软件分析计数。

2．5 克隆形成能力检测培养第4天，倒置显微镜下可观察到典型细胞团，中间为大量的圆形细胞，层层叠叠，外周为纺锤形细胞，向外扩散，以大于50个细胞的细胞团为一个集落，在培养皿上下左右中5个方位各随机取一个视野(×40)计数集落数，取均值。

2．6 EPCs黏附能力检测用0.25％胰蛋白酶消化收集贴壁细胞，悬浮在500μL培养液中，计数，然后将同等数目的EPCs接种在包被纤维连接蛋白的培养板，在37℃培养30min，洗去未贴壁细胞，随机选取10个视野(×200)，倒置显微镜下计数黏附细胞数。

2．7 EPCs迁移能力检测如上述收集贴壁细胞并计数。将100IIL培养液和VEGF(50ng/mL)加入改良的Boy-den小室的下室，将2×104EPCs悬浮在15μL培养液注入上室，培养24h，刮去滤膜上面的未移动细胞，用甲醇固定，Giemsa染色，随机选择5个显微镜视野(×200)计数迁移到低层的细胞。

2．8 EPCs增殖能力试验如上述收集贴壁细胞并计数。再将等量EPCs接种到包被纤维连接蛋白的96孔培养板，每孔加10μL MTI(5me/mL)，培养4h后，吸弃上清液，再加入二甲基亚砜(150μL/孔)，于微量振荡器充分振荡10min，置酶标仪测OD490值。

2．9统计学处理方法采用单因素方差分析比较各组均数，P＜0.05为有显著性差异。

3　结果

3．1 EPCs鉴定培养3天洗去不贴壁细胞及碎片后，可见典型细胞集落：呈白色半透明，略高于培养平面，中间为大量的圆形细胞，层层叠叠，外周为纺锤形细胞，向外扩散。6天后流式细胞仪分析示细胞表达CD34，VE-Cadherin，VEGFR-2及ACl33。荧光显微镜检显示：随培养时间的延长，越来越多的细胞吞噬DiI-ac-LDL，显微镜下激发红色荧光，空白对照及阴性对照均无荧光。培养2周后，Ⅷ因子相关抗原免疫组化阳性，胞浆呈棕色，空白对照及阴性对照不显棕色。

3．2高胆固醇血症患者外周血EPCs数量的变化与对照组相比，高胆固醇组外周血EPCs数量显著下降[(24.53±3.67) vs (6.14±0.84)，P＜0.01]。

3．3高胆固醇血症患者外周血EPCs功能的变化及丹参的影响见表1，与对照组相比，高胆固醇组外周血EPCs集落形成能力、增殖能力、黏附能力及迁移能力均显著下降(均P＜0.01)；培养液中添加复方丹参注射液10μg/mL，使丹参组EPCs集落形成能力、增殖能力、黏附能力及迁移能力较高胆固醇组均显著提高，其中黏附细胞数及迁移细胞数虽仍较对照组低[分别为：(14.79±1.93)vs(20.61±8.41)及(19.41±1.90) vs (22.27±7.98)，均

P＞0.05，但 无统计学差异。

4 讨论

众所周知，高胆固醇血症是动脉粥样硬化、冠心病的重要危险因素：ox-LDL通过对内皮细胞的氧化损伤、诱导内皮细胞凋亡等机制引起内皮功能障碍，从而启动动脉粥样硬化进程。最近的资料表明，高胆固醇血症不仅造成内皮细胞损伤，同样影响内皮祖细胞的数量和功能。2003年，Hill等在研究中观察了45例具有心血管危险因素但没有患心血管疾病的患者外周血EPCs数量变化，发现血胆固醇水平与EPCs数量呈负相关。随后，朱军慧等发现，高胆固醇血症患者不仅外周血EPCs数量明显减少，EPCs数量与血总胆固醇水平和低密度脂蛋白胆固醇水平呈反向线性关系，而且Ⅱ，cs的黏附能力、迁移能力、增殖能力也明显受损。进一步的研究显示ox-LDL是高胆固醇血症患者内皮祖细胞数量功能改变的主要原因。本研究结果显示高胆固醇血症患者内皮祖细胞数量下降，功能受损，与国内外研究相似。高胆固醇血症(ox-LDL)导致EPCs数量减少和功能受损的确切机制尚不明确，目前认为可能与下列因素有关：(1)ox-LDL直接引起EPCs损伤；(2)ox-LDL增加EPC的凋亡；(3)ox-LDL影响EPCs的分化和动员。

内皮祖细胞是指出生后机体中存在的能特异性归巢于血管损伤、血管新生部位并分化成内皮细胞的一群干/祖细胞，参与体内血管内膜损伤的修复过程，在动脉粥样硬化早期预防中起重要作用。有学者发现冠心病病人循环中EPCs数量下降了近50％，迁移能力受损。因此，通过各种手段动员高胆固醇血症患者的EPCs，提高其外周血EPC8数量，保护高胆固醇血症患者的EPC8，恢复其功能，将大大降低高胆固醇血症患者动脉粥样硬化、冠心病的风险。

丹参作为传统的活血化瘀药，广泛应用于心脑血管疾病的防治。近几年来，一系列研究显示，丹参对各种因素引起的内皮细胞损伤有保护作用。张知新等发现丹参水溶性成分一丹参酚酸B低于0.2mg/mL的浓度对葡萄糖一葡萄糖氧化酶造成的氧自由基损伤细胞有明显的保护作用，电镜结果显示其可以保护线粒体等细胞超微结构。徐东波等将内皮细胞与丹参孵育后再给予氧化损伤，结果其SOD、GSH-Px的值均高于直接接触ox-LDL的细胞，而MDA的值却明显降低，提示复方丹参注射液可以在一定程度上保护内皮细胞免于或减轻氧化损伤。吴兴军等发现丹参乙酸镁抑制ox―LDL诱导的内皮细胞凋亡。丹参对内皮祖细胞影响研究较少，笔者前期的研究观察了丹参对内皮祖细胞数量和功能的影响，发现低浓度丹参(2μg/mL)可显著扩增培养EPCs数，提高其集落形成及黏附能力，其作用优于VEGF。本试验结果显示高胆固醇血症患者外周血EPCs克隆形成能力、增殖能力、黏附能力及迁移能力显著降低，培养时添加复方丹参注射液使其克隆形成能力、增殖能力、黏附能力及迁移能力显著恢复，但仍低于健康对照组，其中黏附能力及迁移能力虽仍较对照组低，但无统计学差异。提示丹参可保护高胆固醇血症内皮祖细胞功能。

丹参保护高胆固醇血症内皮祖细胞功能的确切机制尚不清楚。鉴于内皮祖细胞和内皮细胞同属内皮谱系细胞，丹参可能通过(1)抗氧化损伤；(2)抑制内皮祖细胞凋亡；(3)提高机体分泌或内皮祖细胞自分泌VEGF(或上调VEGF受体水平)而促进内皮祖细胞动员及分化等机制影响内皮祖细胞的数量及功能，从而保护内皮祖细胞减低或免于高胆固醇血症(ox-LDL)的损伤。这些机制的明确揭示有待进一步的研究。