自身免疫病治疗中SiRNA的研究进展

关键词 RNA干扰,siRNA,基因沉默,自身免疫病

摘要 RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种由小双链RNA有效地作用于同源RNA序列诱发的“基因沉默”,在探查基因功能和治疗人类疾病方面有广阔的应用前景。小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)是RNAi的主要介导者,它通过双链RNA(dsRNA)使同源基因沉默,也是最广泛使用的以核酸为基础来治疗疾病的基因沉默技术。如今,siRNA已被应用于诸多研究领域,其在自身免疫病(如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化等)中的研究也日益增多。本文将对siRNA的发现、siRNA介导的基因沉默机制以及siRNA在自身免疫性疾病治疗中的应用进行综述。

[中图分类号]R392.11[文献标识码]A

The Progress of siRNA in Autoimmune Diseases Treatment

[Abstract] RNA interference (RNAi) is a process which induce gene silencing by small double-stranded RNA acting on its homologous RNA sequences and has broad application prospects in the exploration of gene functions and treatment of human diseases. SiRNA is one of the small RNA molecules which are central to RNA interference and is the most extensively used gene-silencing technique among the other nucleic-acid based treatment approaches. Nowadays, siRNA has been applied in many fields and also plays more and more important roles in autoimmune diseases, such as rheumatoid arthritis, multiple sclerosis and systemic lupus erythematosus, etc. This review intends to give the reader an overview of the regulatory roles and applications of siRNA in autoimmune diseases as well as the discovery of it, the mechanism of its mediating gene silencing.

[Keywords] RNA interference,siRNA,gene silencing,autoimmune disease

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指外源双链RNA进入细胞,可引起与其序列相同的转录基因mRNA降解的现象。双链RNA分子在RNA酶Ⅲ核酸内切酶Dicer的作用下,被切割产生含21~23个核苷酸(nt)的小双链RN段,称小干扰RNA(small interfering RNAs, siRNA)。它的作用是在mRNA水平关闭相应序列基因的表达或使其沉默的过程,即转录后基因沉默。目前,siRNA是最广泛使用的、以核酸为基础的、治疗疾病的基因沉默技术。已报道的运用siRNA可治疗的疾病包括:癌症、肝炎、呼吸道疾病、心血管疾病、神经元疾病以及自身免疫病[1]。

1 siRNA的发现与作用机制

1.1 RNA干扰的发现

1998年,线虫基因组测序工作完成后,Andrew Fire和Craig Mello首次提出了一项新技术:通过双链RNA(dsRNA)诱导特异基因的沉默,即RNA干扰[2]。这些双链RNA是在体外转录正义RNA时所生成。1999年,Andrew Hamilton 和David Baulcombe随后发现,在拟南芥的转基因株和病毒诱导的转录后的基因沉默中,存在21-25 nt的RNA,该RNA与沉默基因序列互补,其来源是较长的双链RNA前体,这些小分子双链RNA即被称为siRNA[3]。2001年,Elbashir等首次报道siRNA可特异性阻抑哺乳动物细胞靶基因表达,自此,siRNA作为一种新兴的基因沉默技术被广泛运用于生物学和医学等研究领域。

基金项目:上海市教委科研创新重点项目(12ZZ103),上海市卫生局科技发展基金(2011177),

上海市教委重点学科(J50207)

作者简介:赵晴(1989-),女(汉族),江苏南通人,硕士研究生

通讯作者:陈广洁

1.2 siRNA在基因沉默中的作用机制

细胞内的dsRNA(可以是来源于实验导入的、异常表达的转基因,RNA病毒,转座子或者短的内源发夹RNA分子)特异性与Dicer结合,以ATP依赖的方式被切割成siRNA。被Dicer酶切割成的siRNA具有相似的结构特征:长度为21-23 nt的双链RNA,带有3’ 端单链尾巴及磷酸化的5’ 端,互补双链的3’ 端均有2-3nt的单链突出。siRNA中的一条链与蛋白复合物结合后形成RNA诱导沉默复合物(RNA Induced Silencing Complex, RISC),同时解链,正义链离开,然后反义链在ATP的作用下,通过碱基互补配对原则与同源的靶mRNA结合,在核酸内切酶的作用下,将靶mRNA切断,从而阻断其翻译成蛋白质,达到基因沉默的目的。RISC是一种核酸和蛋白质的复合物,包括蛋白质和siRNA,已经在果蝇和人类细胞中得到纯化[4]。另一种情况是,siRNA与mRNA结合后,在依赖于RNA的聚合酶作用下以mRNA为模板、siRNA为引物指导合成dsRNA,然后Dicer酶再切割,导致mRNA降解[5]。

一些研究证明,siRNAs还有其他沉默机制,例如在几种生物中能够通过RNAi途径修饰细胞染色质导致转录水平的基因沉默。

2 siRNA技术

2.1 siRNA的合成方法

目前较为常用的制备siRNA的方法有5种,包括:(1)化学合成:这是最初研究RNAi时所采用的方法,设计siRNA序列后,由合成仪按照序列进行合成,再进行后续的纯化。(2)体外转录:这种方法采用T7 RNA聚合酶,以先合成的DNA链为模板分别转录合成正义和反义RNA,将正义和反义RNA混合。再经退火复性得到dsRNA,从而使合成 dsRNA的成本大大降低。(3)长片段dsRNA经酶降解:根据siRNA形成的原理,首先针对靶基因的mRNA在体外转录合成长的dsRNA。然后在体外用Dicer酶(或者RNase)消化。 这样就形成了含有多个针对目的基因的2l bp的siRNA混合物,再将该混合物转染至细胞。(4)siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNA:先在体外构建能表达dsRNA的载体,再将其转移到细胞内,合成dsRNA;(5)聚合酶链式反应(PCR)制备的siRNA表达框在细胞中表达:是一种由PCR得到的siRNA表达模板。包括一个RNApol Ⅲ启动子、一段发夹结构siRNA和一个RNApol III终止位点,能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中[6]。前3种方法经过体外制备siRNA,然后应用专门的RNA转染试剂将其转染到细胞内,或者采用电转染法将其导入哺乳动物细胞;后两种方法不需要直接操作RNA,依赖能够表达siRNA的DNA载体或者基于PCR的表达载体转染到细胞中,通过转染到细胞的DNA模板在体内的转录得到siRNA。

2.2 siRNA导入哺乳动物细胞的策略

在哺乳动物细胞中通常通过RNAi阻断特定基因的表达,从而可研究相关基因的功能。此研究的基础在于成功地将siRNA导入细胞。常见的导入策略是将靶向特定基因的约21碱基长短的双链siRNAs,或者45-50-mer的发夹结构RNA(small hairpin RNA, shRNA)转染到细胞内[7]。此外,通过质粒表达siRNAs同样可以抑制特定基因的表达。

3 siRNA在自身免疫病治疗中的应用

3.1 类风湿性关节炎类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病,慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变为其主要的临床表现。

目前,类风湿性关节炎的确切病因还未完全阐明,但一些研究证实,细胞因子在软骨和骨侵蚀中有重要的作用,如TNF-α和IL-1。用抗TNF-α和抗IL-1的单克隆抗体治疗,可显着降低软骨和骨侵蚀[8]。天然的IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)已在类风湿性关节炎体内模型中使用。IL-1Ra的基因治疗可显着减少实验性类风湿性关节炎模型小鼠的关节损伤。

运用siRNA技术沉默疾病相关基因的表达,对类风湿性关节炎的治疗也具有广泛的应用前景。如siRNA沉默树突细胞中的CD40、CD80和CD86,可抑制胶原诱导的关节炎的发生。腺相关病毒(AAV)5型介导的关节内TNF-siRNA,可改善小鼠胶原诱导的关节炎。慢病毒载体介导的TNF超家族成员B细胞激活因子的基因沉默,可抑制Th17细胞的增殖、改善小鼠中自身免疫性关节炎的病情[9]。

而不同的siRNA转运载体可增加siRNA在全身循环的时间,帮助其穿过细胞膜。用siRNA纳米颗粒下调TNF-α,可减少胶原诱导的关节炎小鼠中关节局部和全身的炎症反应。在类风湿性关节炎中,siRNA纳米颗粒的生物分布受到激活的免疫细胞影响,如调节性T细胞和活化的巨噬细胞等。但siRNA纳米颗粒如何能够选择性抑制自身免疫应答,却不影响其他免疫功能,至今尚未明确[8]。Aouadi等设计β1,3-D葡聚糖包裹的siRNA微粒,作为一个高效的口服运载工具,沉默小鼠体内巨噬细胞的一种介导细胞因子表达的酶MAKP kinase kinase kinase 4(Map4k4)。该siRNA通过抑制TNF-α和IL-1β的产生,来保护小鼠免于脂多糖(LPS)诱导的致死[10]。这一技术定义了一个新的口服传送siRNA的策略,以此来减弱系统性炎症应答,如类风湿性关节炎、动脉粥样硬化和炎症性肠病等。在局部关节内运送TNF-α或IL-1β特异的siRNA,可在形态学、放射学、组织学水平上有效改善大鼠胶原诱导的关节炎[9]。体内间接转运siRNA也在关节炎的模型中被广泛研究。静脉转运包含TNF siRNA的阳离子脂质体(lipoplex),可显着抑制TNF在膝关节的产生,并在类风湿性关节炎小鼠模型中显示,能完全治愈关节炎的发生[11]。

另有研究发现,将FcγRIII(CD16)的siRNA注射到关节炎患者颞下颌关节的关节间隙,可使FcγRIII阳性的细胞数量减少,该细胞主要负责与IgG结合、激活细胞和刺激细胞因子释放[12]。

在关节炎发生的早期阶段,抗IL-6生物制剂对类风湿性关节炎有治疗作用。然而,用siRNA沉默IL-6和体内NF-kB的配体激活剂——RANKL,对炎症和骨损伤却无治疗作用,但一些研究报道,同时沉默TNF-α和RANKL比单独沉默RANKL有更为明显的治疗效果[13]。

3.2 系统性红斑狼疮

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种弥漫性、全身性自身免疫病,主要累及皮肤粘膜、骨骼肌肉、肾脏及中枢神经系统,同时还可以累及肺、心脏、血液等多个器官和系统,血清中可检测到多种自身抗体和免疫学异常。

IL-2是促进免疫应答的细胞因子。IL-2对于调节性T细胞的形成和功能也有非常重要的作用,对于全身性自身免疫应答,如SLE有重要的控制作用。IL-2的减少是SLE最主要的免疫病理学表现,在SLE疾病模型小鼠和SLE患者中都发现能产生IL-2的T细胞数量明显减少。IL-2的减少可增加机体对传染病的敏感性,亦可减少活化诱导的细胞死亡[14]。

蛋白磷酸酶2A是(PP2Ac)T淋巴细胞中的一种转录因子——磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(pCREB)去磷酸化的主要参与酶。在SLE患者中,蛋白磷酸酶2A催化亚单位的信号强度、蛋白含量、酶活性均增加。研究显示,pCREB能抑制IL-2的产生。用PP2Ac-siRNA处理SLE的T细胞,可降低PP2Ac的蛋白水平和活性,增加cAMP的磷酸化水平,促进pCREB与IL-2、c-fos启动子的结合,从而恢复IL-2的分泌水平[15]。因此,PP2Ac-siRNA可作为一个新型的工具,来调整SLE患者中T细胞产生IL-2的水平。

3.3 多发性硬化

多发性硬化(multiple sclerosis, MS)是一种中枢神经系统脱髓鞘疾病,该病的病变位于脑部或脊髓,中枢神经系统产生大小不一的块状髓鞘脱失而导致临床症状。

在小鼠的研究中发现,蛋白酪氨酸磷酸酶1(SHP-1)是一个对细胞因子的信号、炎症基因表达和中枢神经系统脱髓鞘极为重要的负调控因子。SHP-1是一个含有两个SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶,通过STAT1,STAT3和STAT6负向调节炎性细胞因子介导的信号通路。相关人体研究表明,MS患者的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中包含激活转录因子NF-κB、STAT1、STAT3和 STAT6,这些转录因子能刺激炎症信号通路,提示MS中炎症信号通路的激活可能是导致炎性脱髓鞘反应的原因之一[16]。

多发性硬化中SHP-1蛋白和基因水平明显低于正常人。MS患者PBMCs低表达SHP-1,而STAT6磷酸化水平升高,这些改变增强了炎症脱髓鞘的激活。研究发现,将MS患者和正常人的PBMCs用抗SHP-1的siRNA处理后,MS患者PBMCs中pSTAT6的表达水平增加;用IL-4刺激这些细胞后,SHP-1-siRNA诱导的pSTAT6水平显着增加[17]。而运用STAT6的siRNA则能有效地降低MS患者单个核细胞中磷酸化STAT6的水平。用表达SHP-1的慢病毒转染PBMCs可减低磷酸化的STAT的含量[18]。

3.4 自身免疫性肝病

自身免疫性肝病是一种特殊类型的慢性肝病,是由自身免疫反应引起的肝脏慢性炎症。临床上最典型的包括自身免疫性肝炎和原发性胆汁性肝硬化两类。

在动物肝损伤模型中,肝毒素和病毒性肝炎通过细胞死亡受体Fas导致肝细胞凋亡。研究发现,小鼠静脉注射Fas-siRNA后,自身免疫性肝炎小鼠的肝细胞毒性明显减少,小鼠存活时间延长。证明通过RNA干扰靶向沉默死亡受体Fas,对自身免疫性肝炎小鼠具有保护作用。最近研究发现,沉默caspase-8(Fas受体的下游信号通路),也能对自身免疫性肝炎和病毒性肝炎起到保护[19]。因此,通过以促凋亡基因为靶向的RNA干扰来治疗肝炎具有潜在的可能性。

4 总结与展望

自1998年发现以来,RNAi已成为生命科学研究的一大热点,并且有着诱人的应用前景,它的运用在短时间内从体外细胞、动物试验发展到临床试验,展示其极大的优越性。作为RNAi主要介导者之一,siRNA以其合成相对简单,生产成本较低,已逐渐成为一个非常吸引人的小分子药物家族。活性siRNA转运载体的运用在生物学和临床疾病治疗中产生了巨大的影响。SiRNA在靶向调控自身免疫病中有着广阔的应用前景,将为各种自身免疫病的治疗提供重要的理论和实验依据,其在自身免疫性疾病的调控和治疗中也发挥着越来越重要的作用