五龄期家蚕幼虫血淋巴酚氧化酶活性研究

摘要 以家蚕为试验材料，调查了5龄幼虫从起蚕到熟蚕血淋巴酚氧化酶的活性变化情况。结果表明，酚氧化酶活性呈现出先升高后降低的趋势，其中在5龄起蚕和熟蚕时酚氧化酶活性较低，而在盛食期（5龄第5天）活性最高。

关键词 5龄家蚕；血淋巴；酚氧化酶活性

中图分类号 S881.24 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）08-0240-01

昆虫酚氧化酶（phenol oxidase，PO）一般以无活性的酚氧化酶原（pro-phenoloxidase，PPO）形式存在于血淋巴中，通过特异的丝氨酸蛋白酶级联反应，使其转化为有活性的酚氧化酶[1-2]。它能够催化单酚为O-联苯，再催化O-联苯转变为醌类物质，参与黑色素的形成[3]。由酚氧化酶参与的黑色素形成是昆虫体液免疫防御反应的重要生化过程[4]。本试验以家蚕为研究对象，测定了整个五龄期家蚕幼虫血淋巴酚氧化酶活性，为深入了解家蚕血淋巴酚氧化酶的变化规律提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试家蚕品种为菁松×皓月，人工孵化，饲育温度为25.5～28.0 ℃，湿度为60%～70%，用桑叶饲养。

1.2 试验设计

取5龄起蚕至熟蚕的血淋巴，血淋巴收集到预先加有苯基硫脲的5 mL离心管中。每次取样均设3次重复，每个重复取5头蚕，样品收集后置于-80 ℃保存备用。

1.3 酶液的制备

将家蚕血淋巴转移到含有0.5 mL二甲胂酸钠（CAC）缓冲液（10 mmol/L二甲胂酸钠，20 mmol/L氯化钙，pH值6.5）的离心管中，于4 ℃条件下以5 000 r/min离心10 min收集上清，即为待测酶液。

1.4 酶活性测定

参照Ashida等[5]的方法，量取50 μL待测酶液，加入3 mL PBS缓冲液（pH=6.0）与0.01 mol/L的L-3，4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA），混合均匀，用Thermo Scientific BioMate 3S 紫外可见光分光光度计（美国），在460 nm波长下，测定1 min内吸光度的增大值，6次重复。酶活力单位用U表示，1U=A460/50 μL/min。

2 结果与分析

家蚕五龄期不同发育阶段血淋巴PO的活性变化情况如图1所示。从图中可以看出，家蚕5龄幼虫从起蚕到熟蚕，PO的活力表现为先升后降的变化趋势。5龄起蚕（0 d）PO酶活力最低，第1天和第2天PO活力维持在3.5 U左右，从第3天酶活力开始逐渐升高，在第5天酶活力最高（9.88 U），随后酶活力逐渐减弱，到5龄末期熟蚕时急剧下降至1.59 U，略高于起蚕。

3 结论与讨论

酚氧化酶广泛存在于昆虫体内，在其生长发育及免疫学功能方面都发挥了重要作用[4]。血淋巴是家蚕生长发育不可缺少的重要组织之一，研究血淋巴PO酶活性变化规律不仅对其生理机能有重要的意义，也为深入研究PO提供了理论基础。

本研究结果显示，PO酶活力在家蚕的整个五龄期呈先升高后降低的变化趋势，其活性变化规律与该阶段家蚕的食量及生理进程趋于一致。研究结果与陈文柱等[6]的研究结果基本一致，5龄家蚕一般在第4～5天达到盛食期，PO活性即在第4天和第5天相较高；而在起蚕和熟蚕时PO活性相对较低，这与家蚕生理学研究结果保持一致。家蚕生理学研究结果表明，在每个龄期的中盛食期家蚕抗性较强，而在起蚕及眠期时抗性比较弱[7-8]。

4 参考文献

[1] KAN H，KIM C，KWON H，et al.Molecular control of phenoloxidase-induced melanin synthesis in an insect[J].The Journal of Biological Che-mistry，2008，283（37）：25316-25323.

[2] 时超美.昆虫酚氧化酶原活化及其在免疫中的作用[J].昆虫知识，2000，37（5）：310-314.

[3] 庞秋香，庞书香，赵博生.酚氧化酶及其酶原的生化特征与分子生物学研究进展[J].现代生物医学进展，2008，8（1）：196-200.

[4] 刘丽萍，奚耕思，王芳，等.昆虫酚氧化酶的研究进展[J].生命科学，2013，25（4）：383-387.

[5] ASHIDA M.Purification and characterization of prophenoloxidase from the hemolymph of the silkworm Bombyx morí[J].Archives of Biochemistry and Biophysics，1971，144（2）：749-762.

[6] 陈文柱，李兵，贡成良，等.酚氧化酶在家蚕血淋巴中的活力分布及影响因素的研究[J].江苏蚕业，2005，27（2）：12-15.

[7] 冯丽春，沈卫德.蚕体解剖生理学[M].北京：高等教育出版社，2015：77-81.

[8] 刘丽萍，奚耕思，王芳，等.昆虫酚氧化酶的研究进展[J].生命科学，2013（4）：383-387.