草莓新品种晶玉高效离体再生体系的建立

摘要：以草莓新品种晶玉为试材，研究了不同植物生长调节剂浓度和配比对其叶片、叶柄再生的影响及不同暗培养时间对叶片再生的影响，并筛选出了最佳的生根培养基，建立了晶玉的高效离体再生体系。结果表明，培养基MS+2.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L 2，4-D对晶玉叶片不定芽的分化效果最好，平均不定芽再生率可达81.45%，每叶块平均再生芽数达到4.47个；暗培养7 d有利于叶片不定芽的再生。培养基MS+3.0 mg/L TDZ +0.05 mg/L 2，4-D对晶玉叶柄不定芽再生的效果最好。最佳生根培养基为1/2 MS+ 0.05 mg/L NAA+0.05 mg/L IBA。

关键词：草莓；晶玉；离体再生；叶片；叶柄

中图分类号：S668.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）23-5912-05

晶玉是湖北省农业科学院经济作物研究所以甜查理为母本，晶瑶为父本杂交选育的草莓新品种，于2012年通过湖北省农作物品种审定委员会的审定[1]。该品种具有品质较优、抗炭疽病和白粉病、丰产性好等优势，是生产上很有潜力的一个栽培品种。建立其高效的再生体系，对于草莓品种的种质交换及进一步的遗传转化研究具有重要意义[2，3]。

国内外对草莓的组织培养再生研究已有一些报道，主要集中在对草莓茎尖快速繁殖，不同品种的叶片、叶柄、花药不定芽再生等方面[4-6]。在草莓再生的相关研究中涉及的品种主要是丰香、晶瑶、Tudla、全明星、红颜等[7-12]，但具有高效再生体系的优良草莓品种仍然较少，有必要进一步对新审定的草莓品种进行高效再生体系研究。本研究以晶玉叶片、叶柄为试材，研究了不同激素浓度和配比对叶片、叶柄不定芽分化的影响，暗处理对不定芽分化的影响等，建立了草莓新品种晶玉的高效离体再生体系。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为草莓新品种晶玉，2011年4月种植于湖北省农业科学院经济作物研究所草莓试验圃，6月在田间选取健壮草莓母株上，生长充实而小叶尚未展开的匍匐茎顶端约3～4 cm长的顶芽。

1.2 无菌材料的获得

将匍匐茎顶芽用自来水冲洗干净并擦干，转入超净工作台，按下列程序消毒。70%酒精浸润30 s，无菌水冲洗1次，然后用0.1% HgCl2消毒10 min，无菌水冲洗5次。将处理好的顶芽在无菌纸上逐层剥去幼叶取出茎尖生长点，接于MS培养基上生长，培养条件为温度（25±2） ℃、光照度1 500～2 000 lx、光照时间16 h/d（下同）。茎尖在MS培养基上成活后，在MS+0.5 mg/L BA+0.05 mg/L NAA培养基上继代培养1次，以25 d苗龄无菌试管苗的叶片、叶柄为试验材料。

1.3 不同浓度6-BA与IAA组合对晶玉叶片不定芽再生的影响

取长势健壮、三出复叶均展开的晶玉无菌试管苗叶片，去除叶片边缘部分，切成5 mm×5 mm左右的小块状叶盘，以近轴面向下与再生培养基接触进行培养。再生培养基以MS+30 g/L 蔗糖（Sucrose）+ 2.5 g/L 菲特胶（Phytagel）为基本培养基，pH 5.8，分别添加1.0、2.0、3.0 mg/L 的6-BA与0.1、0.3、0.5 mg/L 的IAA激素配比，50 d后进行观察统计，研究不同浓度的6-BA与IAA组合对晶玉草莓叶片不定芽再生的影响。每个处理80片叶，每处理3次重复。接种后培养条件为：温度（25±2） ℃、光照度 1 500～2 000 lx、光照时间16 h/d（除暗培养外，下同）。

1.4 不同浓度TDZ与2，4-D组合对晶玉叶片不定芽再生的影响

同“1.3”的接种培养方法，以MS+ 30 g/L Sucrose + 2.5 g/L Phytagel为基本培养基，pH 5.8，分别添加1.0、2.0、3.0 mg/L 的噻苯隆（TDZ，Thidiazuron）与0.05、0.10、0.20 mg/L 的2，4-D激素配比，50 d后进行观察统计，研究不同浓度的TDZ与2，4-D组合对晶玉叶片不定芽再生的影响。

1.5 不同浓度TDZ与IBA组合对晶玉叶片不定芽再生的影响

同“1.3”的接种培养方法，以MS+30 g/L Sucrose + 2.5 g/L Phytagel为基本培养基， pH 5.8，分别添加1.0、2.0、3.0 mg/L 的TDZ与0.1、0.3、0.5 mg/L 的IBA激素配比，50 d后进行观察统计，研究不同浓度的TDZ与IBA组合对晶玉叶片不定芽再生的影响。

1.6 不同暗培养时间对晶玉叶片不定芽再生的影响

以MS + 2.0 mg/L TDZ + 0.05 mg/L 2，4-D + 30 g/L Sucrose + 2.5 g/L Phytagel为培养基，pH 5.8，叶盘接种后在（25±2） ℃条件下，分别进行0、7、14、21、28 d的暗处理，在光照度1 500～2 000 lx、光照时间16 h/d的条件下培养，研究不同暗培养时间对晶玉叶片不定芽再生的影响。每个处理80片叶，每处理3次重复。

1.7 不同浓度激素配比对晶玉叶柄不定芽再生的影响

取长势健壮、三出复叶均展开的晶玉无菌试管苗叶柄，切成1 cm左右的小段与再生培养基接触进行培养。再生培养基以MS+30 g/L Sucrose+2.5 g/L Phytagel为基本培养基，pH 5.8，分别添加不同浓度的TDZ与2，4-D或IBA的配比，50 d后进行统计，研究不同浓度激素配比对晶玉叶柄不定芽再生的影响。每个处理80个叶柄切段，每处理3次重复。接种后培养条件为：温度（25±2） ℃、光照度1 500～2 000 lx、光照时间16 h/d。

1.8 晶玉的再生小苗生长与植株生根

将再生的晶玉不定芽在培养基MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA上继代培养1次，当不定芽长至3 cm左右时，将生长健壮的无根小苗接种于不同生根培养基上进行生根培养，25 d后进行观察统计。通过生根率、平均生根数、平均根长、平均根粗等指标综合衡量晶玉的最佳生根培养基。

1.9 数据统计

在不定芽再生过程中，持续观察外植体形态变化及不定芽再生情况。培养50 d后，统计不同处理不定芽再生频率和每个外植体再生的不定芽个数，计算不定芽再生率及每个外植体再生芽数。

不定芽再生频率=再生出不定芽的外植体数/接种的外植体总数×100%

每个外植体再生芽数=外植体再生出的不定芽总数/再生出不定芽的外植体数

试验数据采用Excel 2003软件进行分析，应用SAS 8.0软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度6-BA与IAA组合对晶玉叶片不定芽再生的影响

晶玉叶盘接种于添加了6-BA与IAA不同浓度组合的再生培养基上，愈伤产生量少，且愈伤多为浅绿色、质地较致密坚硬，30 d左右不定芽开始分化。大部分不定芽经愈伤组织分化形成，少量不定芽直接在叶片切口末端形成。如表1所示，不同浓度的6-BA与IAA组合对晶玉叶片不定芽再生的试验中，该组合总体上能够诱导叶片不定芽的再生，但再生频率较低。其中2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA组合对晶玉叶片不定芽再生相对较好，再生率达到19.05%，与其他处理间差异显著。

2.2 不同浓度TDZ与2，4-D组合对晶玉叶片不定芽再生的影响

从表2可以看出，在同一TDZ水平上，晶玉叶片不定芽再生率随着2，4-D浓度的升高呈显著下降的趋势，这说明培养基中附加低浓度（小于0.10 mg/L）的2，4-D有利于晶玉叶片不定芽的再生。叶片接种于添加了TDZ与2，4-D不同浓度组合的再生培养基上，产生愈伤多为黄绿色颗粒状，质地较致密，25 d左右开始形成不定芽。结果表明，2.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L 2，4-D组合对晶玉叶片不定芽再生最好，再生率达到81.45%，显著高于其他处理，平均再生芽数达到4.47个。3.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L 2，4-D组合不定芽再生率也较高，但观察发现，当TDZ浓度较高时（大于2.0 mg/L），再生出的不定芽玻璃化严重，因此TDZ浓度不宜过高，以2.0 mg/L为宜。如图1所示，图1a为晶玉叶片接种7 d后在切口边缘形成明显的黄绿色愈伤，图1b为晶玉叶片愈伤再生出的不定芽。

2.3 不同浓度TDZ与IBA组合对晶玉叶片不定芽再生的影响

在TDZ与IBA不同浓度组合的再生培养基上，晶玉叶片多产生黄绿色颗粒状愈伤、少量为块状，质地致密，30 d左右开始形成不定芽。从表3可以看出，2.0 mg/L TDZ+0.3 mg/L IBA组合对培养晶玉叶片不定芽再生效果最好，平均不定芽再生率达到55.96%，显著高于其他处理，每叶块平均再生芽数达到3.55个；当TDZ浓度进一步提高到3.0 mg/L时，不定芽再生率开始下降，且不定芽以丛生状为主，长势较弱，玻璃化现象严重。

2.4 不同暗培养时间对晶玉叶片不定芽再生的影响

不同暗培养时间对晶玉叶片不定芽再生的影响如表4所示。暗培养7 d平均不定芽再生率最高，达到84.53%，每个外植体再生芽数达到5.01个，显著高于没有暗培养的处理，表明暗培养对晶玉叶片不定芽的再生有一定促进作用。观察发现，进行7 d暗培养，可以减轻晶玉叶片切口的褐化现象，这可能是暗培养促进不定芽再生的主要原因。但暗培养时间过长不利于不定芽的分化再生。

2.5 不同浓度激素配比对晶玉叶柄不定芽再生的影响

不同浓度激素配比对晶玉叶柄不定芽再生的影响结果如表5所示。在13种激素组合中，3.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L 2，4-D组合对晶玉叶柄不定芽再生效果最好，平均不定芽再生率达到57.83%，显著高于其他处理，每叶块平均再生芽数达到3.59个。晶玉叶柄不定芽再生如图1所示，其中图1c为晶玉叶柄接种7 d后在切段两端形成明显的黄绿色块状愈伤，图1d为叶柄愈伤再生不定芽。

2.6 不同生根培养基对晶玉植株生根的影响

再生出来的晶玉不定芽在继代培养基上培养1次后生长成小植株，如图1e所示。在如表6所示的7种生根培养基中，从各项指标综合考虑，晶玉的最佳生根培养基为1/2 MS+0.05 mg/L NAA+0.05 mg/L IBA，其生根率、平均生根数、平均根长、平均根粗分别达到了99.33%、11.67个、3.04 cm、0.80 mm。晶玉不定芽生根形成的完成植株如图1f所示。

3 小结与讨论

影响草莓再生的因素较多，其中草莓品种自身特性、培养基、不同激素的种类和浓度配比等是关键因子。近几年，湖北省草莓育苗期炭疽病病害发生严重[13]，而晶玉是一个对炭疽病具有较高抗性的品种，其在生产上应用潜力较大。晶玉高效的再生体系对于种质交换及进一步的草莓遗传转化研究具有重要意义。

激素种类和配比是影响外植体器官发生的重要因素。在离体培养中一般生长素有利于根的形成，而细胞分裂素有利于芽的形成，通过改变二者的比例可以调节芽的形成。在不同类型的激素组合中，以TDZ与2，4-D配合使用时晶玉再生频率较高，这可能与TDZ强烈的细胞分裂素活性有关。本试验建立了晶玉的高效离体再生体系，2.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L 2，4-D组合对晶玉叶片不定芽再生的效果最好，再生率达到81.45%；3.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L 2，4-D组合对晶玉叶柄不定芽再生的效果最好，再生率达到57.83%。

暗培养也是影响草莓叶片再生率高低的重要因素之一。有相关报道指出[9，14，15]，草莓不同品种再生所需要的合适的暗培养时间各有不同，草莓丰香的最佳暗培养时间是14 d，草莓吐德拉是21 d，草莓幸香是42 d。本研究结果表明，晶玉叶片再生最佳的暗培养时间是7 d。暗培养的主要作用是让外植体在再生过程中减少溢出酚类物质，减轻褐化，维持植物材料较好的生理状态[16，17]，因而有利于再生。

参考文献：

[1] 向发云，曾祥国，冯小明，等.草莓新品种‘晶玉’[J].园艺学报，2012，39（12）：2523-2524.

[2] GRUCHALA A，MALGORZATA K，EDWARD Z.Conditions of transformation and regeneration of‘Induka’ and ‘Elista’ strawberry plants[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2004，79：153-l60.

[3] 尹淑萍，金万梅，王 萍，等.Thidiazuron对草莓外植体再生不定芽的影响[J].农业生物技术学报，2003，11（4）：379-382.

[4] 凤 婷，赵密珍，王 钰，等.草莓品种宁玉再生体系的建立[J].江苏农业学报，2013，29（3）：688-690.

[5] 向发云，曾祥国，冯小明，等.影响‘丰香’草莓花药培养再生的几个主要因素[A].张运涛.草莓研究进展（三）[C].北京：中国农业出版社，2010.43-47.

[6] 张志宏，吴禄平，代红艳，等.草莓主栽品种再生和转化的研究[J].园艺学报，2001，28（3）：189-193.

[7] 秦永华，张上隆，徐 凯，等.‘丰香’草莓叶片高效再生体系的建立[J].园艺学报，2005，32（1）：189-193.

[8] 向发云，吴金平，曾祥国，等.“晶瑶”草莓叶片再生体系的建立[J].江西农业学报，2010，22（11）：28-31.

[9] 吴雪梅，汤浩茹，文国琴，等.不同培养条件对‘丰香’草莓离体叶片再生的影响[J].园艺学报，2004，31（5）：657-659.

[10] 张志宏，吴禄平.草莓主栽品种Tudla遗传转化体系的建立[J].农业生物技术学报，1998（6）：200-204.

[11] 张红梅，王俊丽.‘全明星’草莓叶片遗传转化体系的建立[J].生物技术，2005（15）：68-70.

[12] 董 莉，晁慧娟，董清华，等.红颜草莓叶片再生体系的建立[J].中国农学通报，2010（26）：246-249.

[13] 向发云，韩永超，曾祥国，等.湖北省草莓育苗期炭疽病病害调查[J].湖北农业科学，2012，51（24）：5650-5653.

[14] 孟 楠，刘月学，孙立茹，等.‘吐德拉’草莓叶片离体再生体系的建立[A].张运涛.草莓研究进展（三）[C].北京：中国农业出版社，2010.48-52.

[15] 周厚成，罗 静，赵 霞，等.不同培养条件对幸香草莓离体叶片再生的影响[J].果树学报，2007，24（1）：105-108.

[16] 向发云，曾祥国，冯小明，等.草莓叶柄组织培养再生研究[J].湖北农业科学，2010，49（2）：273-275.

[17] TIAN M，GU Q，ZHU M Y.The involvement of hydrogen of peroxide and antioxidant enzymes in the process of shoot organogenesis of strawberry callus[J]. Plant Science，2003， 165（4）：701-707.