牛磺酸对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞的保护作用

【摘要】目的探讨牛磺酸对糖尿病（diabetes mellitus，DM）大鼠视网膜Müller细胞的影响及机制。方法取雄性SD大鼠随机分为对照组、DM组、牛磺酸组、PBS组（n=6/组），对照组正常大鼠腹腔注射柠檬酸缓冲液，DM组大鼠腹腔注射链脲佐菌素诱导的DM模型，牛磺酸组DM大鼠腹腔注射牛磺酸，PBS组DM大鼠腹腔注射PBS。3个月后试剂盒检测视网膜还原型谷胱甘肽（reduced glutathione hormone，GSH）及含量丙二醛（malondialdehyde，MDA），Western blot检测视网膜胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）及谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）表达。结果对照组MDA及GSH含量分别为（352±051）nmol/mg prot及（9547±873）mg/g prot；DM组及PBS组MDA含量分别为（672±075）、（722±054）nmol/mg prot，较对照组明显增高（P

【关键词】牛磺酸；糖尿病视网膜病变；氧化应激；Müller细胞

Müller细胞是视网膜内最主要的胶质细胞，在调节视网膜光感受器和神经元的功能以及维持血视网膜屏障的完整性中具有重要作用[1]。视网膜氧化应激导致Müller细胞功能受损是糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）的重要机制之一[2]。研究表明，持续给予牛磺酸可抑制DM大鼠视网膜氧化应激[3]，但牛磺酸抑制DM视网膜应激对Müller细胞的影响尚不完全清楚，因此本研究拟探讨牛磺酸对DR大鼠视网膜Müller细胞的影响及其机制，以期为DR的临床防治提供新的思路。

1资料与方法

11材料与仪器雄性SD大鼠，180～220 g（辽宁医学院实验动物中心），牛磺酸（北京嘉康源化工有限公司），还原型谷胱甘肽（reduced glutathione hormone，GSH）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒（碧云天生物公司），链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）及谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）抗体（Sigma公司）。

12实验分组SD大鼠腹腔注射1%的STZ溶液（55 mg/kg，01 mol/L柠檬酸缓冲液溶解），72 h后检测尾静脉血糖浓度>167 mmol/L即为DM模型。牛磺酸溶于01 mol/L 的PBS缓冲液，实验分为4组，对照组（正常SD大鼠腹腔注射柠檬酸缓冲液）、DM组（STZ诱导的DM大鼠模型）、牛磺酸组（DM大鼠腹腔注射牛磺酸50 mg/kg，05 ml/d），PBS组（DM大鼠腹腔注射01 mol/L的PBS），3个月后进行下列分子生物学检测。

13视网膜GSH和MDA含量的检测以10%的水合氯醛麻醉大鼠，剥离视网膜，以生理盐水制成5%组织匀浆，4000 r/min离心取上清液，按试剂盒说明进行操作，根据试剂盒提供公式计算GSH及MDA含量。

14Western blot检测视网膜GFAP及GS蛋白表达制备视网膜组织匀浆，12000 r/min离心15 min，取上清液SDSPAGE电泳后转移至PVDF膜上，以GFAP、GS蛋白和βactin一抗37℃孵育2 h后，用辣根过氧化物酶标记的对应二抗室温孵育1 h，再以增强发光试剂盒显影。

15统计学方法数据以均数±标准差（x±s）表示，利用SPSS软件单因素方差分析LSD检验，P

2结果

21视网膜GSH及MDA含量与对照组相比，DM组及PBS组视网膜GSH含量明显降低，MDA含量明显增加（P005）（表1）。

22牛磺酸对DM大鼠视网膜GFAP及GS表达的影响以βactin为内对照，与对照组相比，DM组及PBS组GFAP表达上调，GS表达明显下调，而牛磺酸组GFAP及GS表达均无明显改变（图1）。

3讨论

Müller细胞占视网膜细胞总数的4%～5%，约占视网膜胶质细胞90%以上，贯穿于视网膜全层，与视网膜光感受器、神经元、其他类型胶质细胞以及视网膜血管等具有紧密联系，不仅在神经元的营养及兴奋性传递中也发挥重要作用，在维持细胞外环境稳态、调节视网膜微血管通透性以及血视网膜屏障完整性中页发挥重要作用[1]。

Müller细胞氧化应激导致结构和功能异常是DR的重要原因之一，Müller细胞受损表现为GFAP表达上调[1]。Müller细胞主要位于内核层，其突起布及内界膜至外界膜的整个视网膜，形成广泛的突触联系。本研究发现，DM 3个月时大鼠视网膜GSH含量降低，MDA增加，出现了氧化应激表现，而DM大鼠给予牛磺酸可明显增加视网膜GSH含量，并降低视网膜MDA含量。结果提示牛磺酸可抑制DM大鼠视网膜氧化应激反应。此外，DM大鼠视网膜发生氧化应激的同时GFAP表达上调，牛磺酸抑制DM视网膜应激的同时下调了GFAP表达，实验结果提示DM大鼠视网膜氧化应激导致了Müller细胞受损，而牛磺酸通过抑制氧化应激保护Müller细胞受损。本实验检测了视网膜GS的表达变化，以进一步探讨牛磺酸抑制氧化应激对DM视网膜Müller细胞功能的影响。Müller细胞是视网膜中唯一可以合成GS的细胞，GS可将谷氨酸转运体（glutamateaspartate transporter，GLAST）逆浓度差由细胞外转运至Müller细胞内的谷氨基酸转化为谷氨酰胺，消除谷氨酸堆积所产生的细胞毒性，以防视网膜神经元发生退行性改变[4]。本研究发现，DM大鼠视网膜氧化应激时GS表达下调，而牛磺酸抑制DM大鼠视网膜氧化应激可上调GS表达。结果提示，牛磺酸可能通过上调GS在Müller细胞中的表达促进了谷氨酸转化，在消除谷氨酸堆积的细胞毒性、预防视网膜神经元退行性变以及DR临床治疗中发挥积极作用。

本研究为牛磺酸防治DR提供了思路，但牛磺酸对DM大鼠Müller细胞GLAST的活性及功能的影响尚不完全清楚，在清除DM大鼠视网膜谷氨酸的作用仍有待进一步探讨。

参考文献

[1]Grosche A， Pannicke T， Karl A， et al Physiologic properties of Müller cells from human eyes affected with uveal melanoma Invest Ophthalmol Vis Sci， 2012， 53（7）：41704176.

[2]张强，左中夫，刘学政 姜黄素对高浓度葡萄糖培养的RF/6A细胞活力的影响 国际眼科杂志， 2012， 12 （9）： 16361638.

[3]Di Leo MA， Santini SA， Cercone S， et al Chronic taurine supplementation ameliorates oxidative stress and Na+ K+ ATPase impairment in the retina of diabetic rats Amino Acids， 2002， 23（4）：401406.

[4]Ishikawa M， Yoshitomi T， Zorumski CF， et al Downregulation of glutamine synthetase via GLAST suppression induces retinal axonal swelling in a rat ex vivo hydrostatic pressure model Invest Ophthalmol Vis Sci， 2011， 52（9）：66046616.