新型褪黑素受体激动剂Neu―240改善帕金森模型小鼠运动行为损伤

【摘要】 目的：评估一种新型褪黑素受体激动剂Neu-240对MPTP（1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶）诱导帕金森模型小鼠运动功能损伤的潜在保护作用。方法：C57BL/6小鼠每天腹腔注射一次MPTP（30 mg/kg），连续注射5 d，建立PD小鼠模型；Neu-240（0.1或3 mg/kg）腹腔注射开始于MPTP注射的第1天，1次/d，连续17 d。分别在MPTP注射后第14、15及17天进行行为学检测，包括开放场测试、爬杆测试及悬挂测试。结果：在开放场测试与悬挂测试中，Neu-240能够分别显著性改善MPTP诱导的活动距离与运动评分水平的降低；在爬杆测试中，Neu-240对MPTP诱导的转向时间和总时间无显著性影响，仅表现为改善的趋势。结论：新型褪黑素受体激动剂Neu-240能部分改善帕金森模型小鼠运动功能损伤。

【关键词】 Neu-240； MPTP； 帕金森病； 爬杆测试； 悬挂测试

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是一种多发于老年人群并有向中年移行趋势的中枢神经退行性疾病；其症状表现为动作迟缓，肢体僵硬，静止性震颤等运动功能障碍，同时多伴有幻觉、多梦、睡眠品质降低、精神错乱、焦虑及抑郁等精神症状[1]。帕金森病的典型病理特征为中脑多巴胺能神经元缺失导致多巴胺分泌不足以及多巴胺能神经元胞质内路易小体的生成，但其确切病因至今未明[2]。PD不仅严重影响患者个人的生活品质，也给家庭和社会带来沉重负担[3]；因此，阐明PD神经病理机制及寻找新型低毒有效的临床治疗药物一直是一个巨大的挑战。

哺乳动物体内的褪黑素主要由松果体在夜间合成和分泌，为褪黑素受体的天然配体；褪黑素对昼夜节律及睡眠等多种生理活动具有重要的调节作用[4]。近年来研究结果表明，褪黑素可通过多种机制在神经退行性疾病（如AD、PD、中风等）发生发展过程中起着有益的调节作用[5]。Neu-P11是一种用于治疗失眠的新型褪黑素受体激动剂，具有高褪黑素受体亲和力及增强γ-氨基丁酸能神经传递的特性[6]。最近研究结果表明，Neu-P11具有促进睡眠及抗抑郁与抗焦虑的功能[6-7]；另外，Neu-P11亦能改善AD模型大鼠认知功能损伤[8]。

目前，研究PD的动物模型主要有生物毒素模型和基因模型两大类；其中基于MPTP（1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶）损伤的动物模型由于其在神经化学、病理和行为学方面与人类PD具有极大相似性因而得以广泛采用。Neu-240为新近合成的Neu-P11的结构类似物，本研究检测了Neu-240对MPTP诱导PD模型小鼠运动行为损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验动物为成年雄性C57BL/6小鼠，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。小鼠每5只合笼饲养于温度（25±2）℃、湿度恒定的环境中，自由取食和饮水。动物处于“12 h明-12 h暗”的周期中，每天早上7点钟开启照明装置。实验开始前，小鼠熟悉实验环境1周，实验者每天接触每只小鼠5～6 min以使其熟悉实验者以减少应激。实验操作遵照美国国立卫生研究院的《国家实验动物健康与管理条例》进行。

1.2 药品 Neu-240由以色列Neurim Pharmaceuticals Ltd.提供；Neu-240溶解于1滴Tween-80，然后用含有1% DMSO的无菌生理盐水稀释到最终浓度，于注射前现配。MPTP购自美国Sigma公司，溶解于生理盐水，于注射前现配。

1.3 动物分组与药物处理 小鼠PD模型建立参考以前方法[9]，MPTP模型组小鼠每天腹腔注射一次MPTP（30 mg/kg），连续注射5 d，模型对照组小鼠腹腔注射等体积生理盐水。Neu-240（0.1或3 mg/kg）或溶媒腹腔注射开始于MPTP注射的第1天，1次/d，连续17 d。小鼠随机分为六组：（1）对照组（n=10）：给予生理盐水与溶媒处理；（2）Neu（0.1）组（n=5）：给予生理盐水与0.1 mg/kg Neu-240处理；（3）Neu（3）组（n=5）：给予生理盐水与3 mg/kg Neu-240处理；（4）MPTP组（n=10）：给予MPTP与溶媒处理；（5）MPTP+Neu（0.1）组（n=10）：给予MPTP与0.1 mg/kg Neu-240处理；（6）MPTP+Neu（3）组（n=10）：给予MPTP与3 mg/kg Neu-240处理。六组小鼠分别在MPTP注射后第14、15及17天进行行为学检测，包括开放场测试、爬杆测试及悬挂测试。

1.4 行为学检测

1.4.1 开放场测试 将小鼠从鼠笼取出放进自发活动检测箱（40 cm×40 cm×50 cm）（上海吉量软件科技有限公司），通过视频采集系统录像5 min并保存用于进行离线分析。应用该公司提供的软件对每只小鼠在自发活动检测箱中的活动距离进行分析。

1.4.2 爬杆测试 自制一个直径1 cm长50 cm并且顶端固定有一个直径为1.5 cm的软木小球的木杠，缠上纱布以增加摩擦力，将木杆竖直固定。在MPTP注射前训练小鼠适应该装置2次。实验时，将小鼠头朝上放置于软木球下方不远处，开始计时，直到小鼠先爬上软木小球并折返回到杠的底部为止。记录分析的指标为转向时间（T-turn）与总时间（T-total）；转向时间是指将小鼠头朝上放置于软木球下方不远处开始直到小鼠爬上软木球然后头部完全朝下为止所花的时间，总时间是指将小鼠头朝上放置于软木球下方不远处开始，直到小鼠先爬上软木小球并折返回到杠的底部为止所花的时间。

1.4.3 悬挂测试 将小鼠双前肢悬挂于一水平电线上，如小鼠用双后肢抓住电线记3分；仅用一只后肢抓住电线记2分；两后肢均抓不住记1分；小鼠跌落记为0分。

1.5 统计学处理 使用Sigma Stat 3.2统计学软件对数据进行处理，计量资料以（x±s）表示，采用单因素方差分析方法，Post-hoc分析采用Tukey HSD方法，以P

2 结果

2.1 开放场测试 单因素方差分析表明小鼠在5 min内的活动距离有显著性主效应[F（5，44）=3.324，P0.05）；MPTP组小鼠活动距离与对照组比较显著降低（P

图1 开放场测试中各组小鼠在5 min中时间内活动距离的比较

注：*与对照组比较，P

2.2 爬杆测试 单因素方差分析表明小鼠转向时间（T-turn）有显著性主效应[F（5，44）=10.574，P0.05）；MPTP组小鼠转向时间与对照组比较显著性升高（P0.05）。单因素方差分析表明小鼠攀爬总时间（T-total）有显著性主效应[F （5，44）=6.685，P0.05）；MPTP组小鼠攀爬总时间与对照组比较显著性升高（P0.05）。

图2 爬杆测试测试中各组小鼠转向时间（T-turn，左侧）与总时间（T-total，右侧）的比较

注：与对照组比较，**P

2.3 悬挂测试 单因素方差分析表明小鼠在悬挂测试中的评分有显著性主效应[F （5，44）=7.549，P0.05）；MPTP组小鼠评分与对照组比较显著性降低（P

图3 悬挂测试测试中各组小鼠评分的比较

注：***与对照组比较，P

3 讨论

本研究检测了一种新近合成的新型褪黑素受体激动剂Neu-240对MPTP诱导PD模型小鼠运动功能损伤的影响。与以前的实验结果一致，本实验采用的方法能够可靠地诱导小鼠产生PD样运动功能损伤[9]。在开放场与悬挂测试中，Neu-240能够显著性改善MPTP诱导的活动距离与运动评分水平的降低，表明Neu-240能够改善MPTP诱导的PD模型小鼠运动功能损伤。在爬杆测试中，笔者观察到Neu-240处理组小鼠的转向时间和总时间与MPTP组小鼠比较表现出剂量依赖的下降趋势但并未达到显著性差异水平；其原因可能与两个因素有关，一是Neu-240的处理剂量，二是所采用的行为任务的性质差异。

PD的典型病理特征表现为黑质-纹状体系统多巴胺能神经元的进行性减少，但其确切病因至今未明。MPTP发挥神经毒性作用的主要是其代谢产物MPP+，MPP+能够直接抑制线粒体呼吸链功能，也能诱导小鼠脑细胞与SK-H-SH培养细胞DNA裂解及c-Jun的磷酸化[10-11]。线粒体与多巴胺代谢功能异常所诱导的氧化应激与自由基生成可能在PD病理进程中发挥着重要作用[12]；此外，PD的发生发展可能也与线粒体依赖的细胞凋亡信号通路激活密切相关[13]。

研究表明，褪黑素可改善H2O2诱导的PD模型细胞线粒体钙过载、线粒体膜电位去极化、ROS生成及细胞色素C的释放[14]。褪黑素能抑制星形胶质细胞与多巴胺能神经元内诱导的caspase-3的激活，也能降低MPP+诱导的SK-N-SH细胞与小脑小颗粒神经元caspase-3的激活[12]。此外，褪黑素能够通过抑制钙蛋白酶/cdk5信号级联保护MPP+诱导的小脑小颗粒神经元凋亡[11-12]。进一步实验结果表明，褪黑素能够阻断大鼠星形胶质细胞、中脑及纹状体神经元MPT依赖的核DNA凋亡片段的生成[14]。JNK信号可通过激活细胞凋亡与转录因子参与PD病理进程，褪黑素可抑制MPP+诱导的SK-N-SH培养细胞JNK信号级联反应及c-Jun的磷酸化[11]。上述实验结果提示，激活褪黑素受体可能是改善PD症状的一个有效靶点。

Neu-240是新近合成的Neu-P11结构类似物，笔者未公开发表的实验结果显示Neu-240也具有高褪黑素受体亲和力及增强γ-氨基丁酸能神经传递的特性。本实验结果表明了Neu-240能够部分改善MPTP诱导的PD模型小鼠运动功能损伤，其机制可能与激活褪黑素受体密切相关。在下一步工作中，一方面，笔者拟采用6-羟基多巴胺微量注射诱导PD大鼠模型进一步检测Neu-240对PD样运动功能损伤的改善作用；另一方面，进一步阐明Neu-240改善PD样运动功能损伤的神经机制。

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（收稿日期：2014-09-03） （本文编辑：蔡元元）