七叶亭对巨噬细胞株TNF―α、IL―6和NF―κB影响的实验研究

【摘 要】目的：探索七叶亭（Esculetin）对巨噬细胞株RAW264.7细胞活性及分泌炎性因子TNF-α、IL-6和NF-κB表达的影响。方法：分别加入12.5、25、50μM的Esculetin与巨噬细胞RAW264.7共培养24h后，MTT观察不同浓度Esculetin对细胞活力的影响； ELISA检测上清液中TNF-α、IL-6含量；Western blot检测NF-κB的表达。结果：不同浓度的Esculetin对RAW264.7活力无明显影响；不同浓度的Esculetin可抑制巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6，浓度越高，抑制作用越强；Esculetin抑制NF-κB蛋白的活化作用随浓度变化而不同，25μM和50μM对NF-κB活化的抑制作用最强。结论： Esculetin对巨噬细胞株RAW264.7的活力无明显影响；Esculetin能抑制炎性因子TNF-α、IL-6的分泌，并呈剂量依赖关系；能抑制NF-κB蛋白的活化。其发挥抗炎作用有可能是依赖NF-κB信号通路而完成的。

【关键词】七叶亭；巨噬细胞；TNF-α；IL-6；NF-κB

【中图分类号】R 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2012）12-0013-03

动脉粥样硬化（atherosclerosis， AS）是缺血性心脑血管病的病理基础，心脑血管病发病率与死亡率近年也明显增加。AS具有慢性炎症反应特征的病理过程[1]，而且AS从粥样硬化斑块形成到斑块破裂，导致血栓形成的各个阶段，都有炎症细胞和炎症介质参与。本研究用七叶亭（Esculetin）作用于巨噬细胞 RAW264.7，观察巨噬细胞活性、分泌TNF-α、IL-6以及对NF-κB活化的影响，探讨七叶亭抑制炎症反应-抗动脉粥样硬化的可能机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株 小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7购自中科院上海细胞生物学研究所

1.2 实验试剂 七叶亭（ Alfa公司），MTT （ Sigma公司 ），胎牛血清（杭州四季青生物材料有限公司），DMEM培养基（南京凯基生物工程有限公司），小鼠TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），兔抗NF-κB p65，p-NF-κB p-p65抗体（Cell signaling公司），β-actin蛋白多克隆一抗，山羊抗兔二抗，马抗小鼠二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3 主要仪器与设备

低温高速离心机（中国科大创新股份有限公司），电热恒温水浴箱（北京医疗设备厂），Olympus荧光倒置显微镜（日本Olympus公司），酶标仪Bio-Rad 550（美国伯乐公司），微型高速离心机（珠江黑马医学仪器有限公司），-80℃超低温冰箱、超净工作台（美国Forma公司），CO2培养箱（香港力康Heal force公司），微量加液器（芬兰Biohit公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞活性的 MTT检测

（1）接种细胞：用0.25%胰酶-0.02% EDTA消化液将培养的第3代RAW264.7细胞从细胞培养瓶壁消化下来，再用含10%胎牛血清培养基配成单细胞悬液，调细胞密度2.5×104个/mL，每孔200μL，接种在96孔板中；（2）实验分组：空白对照组，Esculetin12.5μM，Esculetin25μM，Esculetin50μM（见表1）。每组设4个复孔；（3）细胞培养：37℃、5% CO2条件下培养，24h后换无血清DMEM培养液，继续孵育24 h后加入药物干预24h；（4）呈色：分别于药物作用结束前4h，每孔加5mg・mL- 1 MTT 20μL，4h后终止培养，吸弃孔内上清液，每孔加150μL二甲基亚砜（DMSO），振荡10min使结晶充分溶解；（5）比色：在酶标仪上490 nm波长处测定吸光度。

1.4.2 巨噬细胞 RAW264.7分泌TNF-α、IL-6的检测

用含10%胎牛血清培养基培养RAW264.7细胞，细胞长满瓶底80%时，弃去培养基，加PBS液漂洗 2次；加入含胰酶和EDTA的消化液1-2ml，37℃消化约2min，镜下可见细胞基本圆形回缩即中止消化；弃消化液加PBS液漂洗 2次，加入新培养液10 ml，反复吹打混悬细胞，细胞密度调整为1×55/ml；以每孔 1ml细胞悬液将细胞接种到6孔板，每孔再加培养基4ml；然后将6孔板放入 5%CO2孵箱37℃培养24h，待细胞长满瓶底80%时（见图1），弃去上清液，分别加入终浓度为0（空白对照），12.5μM，25μM，50μM的含药培养基DMEM， 继续培养24h。收集每孔培养基2ml，1000r/min离心20 min，取上清液，放入-20℃保存，留作检测TNF-α、IL-6。TNF-α、IL-6的检测分别按TNF-α、IL-6ELISA试剂盒说明书操作，每组设复孔10个。

1.4.3 巨噬细胞RAW264.细胞NF-κB活化水平的检测

（1）选择生长良好的巨噬细胞，胰蛋白酶制备细胞悬液，分入6孔板（选用其中4孔），调整细胞密度，待细胞贴壁生长至80-90%汇合时，吸弃原含10%胎牛血清的培养液，换用无血清的DMEM培养液继续培养24h，使巨噬细胞同步化，处于G0/G1期。各实验组加入相应药物干预，对照组不处理，放入培养箱中继续培养，在24h后结束培养。取出6孔板，倒掉培养基，预冷的4℃PBS液润洗培养板2次，吸净残液，用细胞刮刀将细胞刮下，离心收集，加入细胞膜裂解液，混匀后冰浴15min，13000g离心15min，上清液作为胞浆蛋白提取物进行蛋白质印迹分析；沉淀用细胞膜裂解液洗涤一次，混悬于细胞核裂解液，混匀后-20℃冷冻过夜，13000g离心15min，上清液作为白提取物进行蛋白质印迹分析，用于分析NF-κB p65入核；（2）用BCA蛋白测定试剂盒说明书分别测定胞浆蛋白和白浓度；（3）SDS-PAGE凝胶电泳分离，电转移蛋白至PVDF膜，用5 %的脱脂奶粉在室温下封闭1h，洗膜后加入一抗在摇床孵育2h，然后4℃过夜，第二天洗膜后加入二抗在室温孵育2h，漂洗去除未结合的二抗，在暗室中进行显色。

1.5 统计学分析

使用GraphPad Prism 5.0分析软件，数据以mean ± S.E.M.表示。各组间的比较采用单因素方差分析 （One-Way ANOVA）。P

2 结果

2.1 Esculetin对巨噬细胞活性的影响

本试验选用浓度分别为12.5μM、25μM、50μM的Esculetin作用于巨噬细胞，观察Esculetin对细胞活力的影响。与对照组相比，不同药物浓度的Esculetin对细胞活力无明显影响 （P>0.05）

2.2 Esculetin对巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6的影响

与对照组相比较，不同浓度的Esculetin组上清中TNF-α、IL-6浓度明显降低（P

2.3 Esculetin对NF-κB蛋白表达的影响

与对照组相比较，不同浓度的Esculetin对NF-κB p65的活化水平有明显抑制（P

3 讨论

AS是一个复杂的慢性炎症性病理过程[1]，它具备组织细胞变性、坏死，单核/淋巴细胞渗出，平滑肌细胞纤维性增殖等经典炎症反应的基本病理学特征[ 2-3]。同时也存在一般慢性炎症反应所没有的特殊现象，如脂质沉积、钙化和血栓形成等，且有免疫系统参与[4]。大量的炎症因子对AS的形成和发展发挥了至关重要的作用[5]。而血管壁的炎性反应最初是对血管损伤的保护机制，通过炎性细胞如单核细胞、巨噬细胞增生保持机体内环境的稳定，但如果炎症未能及时消除，则会对组织、血管造成破坏。抗炎干预是防治AS的新的研究方向和途径[6]。研究炎症反应在AS发生、发展和恶化中所起的作用，有助于理解不同的干预措施减少临件的机制，本实验将抑制巨噬细胞炎症因子表达作为抑制AS发生、发展的重要手段。

很多中药具有抗炎、 抗肿瘤和免疫调节等作用，采用具有抗炎作用的中药治疗AS可能成为很有希望的研究方向。Esculetin是双香豆素类的衍生物，具有很多生物学活性，具有很强的抗炎作用，临床上有用于对骨关节炎的治疗[7]；其传统功效清热燥湿、平喘止咳、收涩、明目，可用于治疗细菌性痢疾、肠炎和气管炎有很好的效果。Esculetin还是一种脂溶性药物，易穿透细胞膜，并在动脉壁内扩散[8-9]；Esculetin能干扰细胞增生周期，有效抑制炎症介导促细胞增殖作用[10]。

目前认为巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞等炎性细胞的激活是AS始动环节，巨噬细胞参与从脂质沉积到斑块破裂的所有过程[11]。由于巨噬细胞的浸润，进一步引发局部和全身天然的和继发的免疫反应[12]，监测和调控外周血单核和动脉组织巨噬细胞是防治AS的首要和关键因素。RAW264.7细胞是来源于小鼠巨噬细胞的细胞系，来源广泛、贴壁易养、性质稳定，具有巨噬细胞的特性，在许多研究形成的通路、抗炎药物的作用机制以及炎症信号传导通路的实验中，很多都以RAW264.7巨噬细胞作为研究对象[13-15]。本实验以巨噬细胞株RAW264.7为作用细胞，选用浓度分别为12.5μM、25μM、50μM的Esculetin培养24h，并通过MTT来检测药物对细胞的影响，结果显示不同药物浓度对细胞活力没有影响。

巨噬细胞之所以能在AS中发挥作用，与其分泌的多种细胞因子（如IL-1β、IL-6和TNF-α等）有关[5]。IL- 6、TNF-α通过细胞一系列的信号转导活化NF-κB，使炎症介质和细胞因子的基因转录增强，进一步促使中膜的平滑肌细胞向内膜下迁移、增殖并发生表型转化，还导致更多的炎症介质TNF-α和IL-6释放，促使更多的单核细胞聚集、浸润，而TNF-α和IL-6又可作为NF-κB的胞外刺激信号，进一步激活NF-κB，导致最初的炎症信号进一步放大，最终导致AS 病变的发生发展[16]。目前人们对于细胞因子间存在着“交叉联系”，其复杂网络中各环节的具体作用及详细机制还了解不足，故尚须进行大量的实验研究过程，来探讨可能从内在的分子机制。我们的实验以炎性因子TNF-α、IL-6的分泌为切入点，证实Esculetin能抑制炎性因子TNF-α、IL-6的分泌，并呈现明显的剂量依赖性，随着药物浓度的增加，抑制炎症因子分泌的作用也越来越强，通过抑制炎性因子分泌证明Esculetin的抗炎作用。观察不同浓度的Esculetin对NF-κB的蛋白活化的影响。Western blot结果证实，与对照组相比，不同浓度的Esculetin可抑制NF-κB p65的蛋白表达，从而我们猜想Esculetin是通过NF-κB信号通路抑制巨噬细胞发挥抗炎作用。

综上所述，Esculetin能够通过NF-κB有效抑制巨噬细胞炎性因子的分泌，从而有效抑制血管炎症反应，发挥抗AS的作用。目前国内外尚鲜有关于此方面的报道，但随着中药日趋受到重视和越来越广泛的心血管临床应用，挑选新的低毒、低廉、高效的心血管药物越发重要，我们认为Esculetin这种抗AS的中药将可能有效用于心血管疾病的治疗中，本研究初步提供Esculetin抗AS的理论和实验依据，为日后Esculetin在心血管临床的应用奠定基础，相信不久的将来，对Esculetin在心血管中应用会有更深层次的了解。

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