鸽源空肠弯曲杆菌的分离鉴定及毒力因子分析

摘要：通过从活禽市场上取鸽子泄殖腔拭子，分离鉴定了4株空肠弯曲杆菌（Campylobater jejuni）菌株，PCR调查发现，4株菌株均具有细胞膨胀毒素等9个重要的毒力相关因子。选取其中2株进行毒力基因序列分析，序列比对结果显示该鸽子源空肠弯曲杆菌的毒力基因序列与已测序的同时从人和禽屠宰场中分离到的空肠弯曲杆菌M1株的毒力基因相似度最高。

关键词：鸽子；空肠弯曲杆菌（Campylobater jejuni）；毒力因子

中图分类号：S831 文献标识码：B 文章编号：0439-8114（2013）24-6120-04

弯曲杆菌病（Campylobater jejuni）是在世界范围广泛流行的共患病，该病引起成人和儿童腹泻，已经成为危害食品安全的重要食源性疾病，其病原主要为空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）等弯曲杆菌属的细菌[1]。空肠弯曲杆菌宿主范围广，是野生、家养动物的正常寄居菌，在肠道内有大量细菌，感染的动物通常无明显病症，但可长期向外界排菌，通过排泄物或分娩污染食物和饮水，从而引起人类感染[2]。

鸽子也是空肠弯曲杆菌的自然宿主之一，随着鸽子越来越多的被人工饲养，并摆上餐桌或者成为宠物，鸽子也成为人感染弯曲杆菌病病原潜在的中间宿主。本研究从活禽市场上取鸽子泄殖腔拭子分离鉴定到4株空肠弯曲杆菌菌株，并进行了毒力基因和毒力相关基因的分析，认为本次活禽市场上分离的空肠弯曲杆菌具有感染人类的潜在威胁。

1 材料与方法

1.1 菌株

C. jejuni ATCC 33291菌株购自中国菌种保藏中心，该菌分离自人的粪便。临床分离菌株由动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室分离保存。

1.2 试剂与仪器

用于空肠弯曲杆菌分离培养和增菌的改良CCD琼脂（mCCDA）培养基和布氏肉汤培养基购自青岛海博生物技术有限公司。厌氧培养罐和微需氧产气袋购自OXOID公司，rTaq酶、dNTPs、DNA maker购自宝生物（大连）工程有限公司。DNA琼脂糖胶回收试剂盒购自Axygen公司。细菌基因组提取试剂盒购自Omega公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株的分离 在活禽市场随机取鸽子泄殖腔拭子标本50份，直接划线接种于mCCDA平板，在微需氧环境下培养48～72 h，观察菌落特征，挑取可疑菌落进行革兰氏染色鉴定，利用显微镜进行形态观察，并进一步进行分离纯化。

1.3.2 DNA模板的制备 在mCCDA平板上挑取培养的空肠弯曲杆菌单菌落，经液体培养基培养增菌后，使用细菌基因组提取试剂盒提取空肠弯曲杆菌的基因组，详细步骤见试剂盒说明书。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离与鉴定结果

取鸽子泄殖腔拭子划线分离，经过纯化后观察到4株空肠弯曲杆菌疑似菌株，分别命名为G2-14、G2-19、G2-20、G2-31，该菌在mCCDA平板上观察到扁平、灰色、湿润、有光泽、呈沿线扩散生长且边缘不规则的菌落，经革兰氏染色后该菌呈红色，为革兰氏阴性菌株，菌株较其他常见肠道菌如大肠杆菌、沙门氏菌的小，形态细长，呈弯曲状或海鸥状，与购买的空肠弯曲杆菌标准菌株形态一致。

2.2 菌株的16 S rRNA测序鉴定结果

分离菌株使用细菌扩增16 S rRNA的通用引物成功扩增出长度约为1 500 bp的DN段，测序后结果与空肠弯曲杆菌的16 S rRNA序列100%同源，证明分离的菌株G2-14与G2-31为空肠弯曲杆菌。

2.3 毒力相关基因的鉴定

选取G2-19、G2-31和空肠弯曲杆菌标准菌株C. jejuni ATCC 33291，使用9对引物分别扩增了毒力因子或毒力相关因子（cdtA、cdtB、cdtC、ciaB、cheY、cadF、peb1、fliA和flaA）的部分片段，如图1所示，片段大小均与预期相符，2株分离的空肠弯曲杆菌和购买的标准菌株均编码有这些毒力基因或毒力相关基因。

2.4 毒力基因的序列分析

为了进一步分析菌株之间的差异，将以上扩增的毒力基因或毒力相关基因片段进行测序，并将测序结果与已经全基因组测序的空肠弯曲杆菌菌株相关序列进行比对，比对菌株包括人源菌株C. jejuni NCTC 11168、C. jejuni 81-176、C. jejuni 81116、C. jejuni M1、C. jejuni ICDCCJ07001，鸡源菌株C. jejuni RM1221、C. jejuni S3，羊源菌株C. jejuni IA3902和C. jejuni PT14。其中C. jejuni M1同时在病人和家禽屠宰场分离到，为家禽到人类的传播提供了直接证据[4]。比对结果发现各菌株flaA基因序列差异较大，其余各个毒力相关基因序列相似性都达到90%以上，其中部分基因非常保守，如cheY，但是其他基因还是存在一定碱基的差异。其中分离菌株G2-14、G2-31和C. jejuni M1相似度最高，如表3所示，除flaA以外，相似度均达到99%以上，对序列进行聚类分析显示，分离菌株G2-14、G2-31和C. jejuni M1均聚为一类，尤其是cdtB、cdtC和fliA基因，G2-14、G2-31、C. jejuni M1达到100%一致（图2），而与其他大部分测序的菌株均呈现出多个位点的碱基差异。

3 小结与讨论

弯曲杆菌病已经成为造成人类腹泻的重要病因之一，其中空肠弯曲杆菌是最为重要的病原，该菌宿主范围较广，覆盖鸡、鸭等禽类动物以及猪、牛等哺乳动物，肉制品污染弯曲杆菌已经成为人类感染弯曲杆菌病的重要原因[5]。以往的研究中采集鸡、鸭等样品，分离到大量的弯曲杆菌[6]，本研究从活禽市场鸽子泄殖腔拭子样本中分离到空肠弯曲杆菌，说明活禽市场中鸽子也是重要的空肠弯曲杆菌携带源，提示在饲养或者食用鸽子的过程中，也要做好弯曲杆菌的防范工作。

空肠弯曲杆菌致病主要包括了4个步骤：黏附上皮细胞、定植消化道、侵入靶细胞和产生与释放毒素[3，7]。在这个过程中，一系列毒力因子和毒力相关因子发挥了重要作用。fliA基因编码了鞭毛合成蛋白，调控了细菌的运动性、蛋白分泌和细胞黏附与侵入是影响细菌毒力的重要因子[8]；cdtABC编码了空肠弯曲杆菌惟一的毒素——细胞致死膨胀毒素，被认为是主要的致病相关因子[9]。ciaB编码弯曲杆菌侵入抗原[10]，cadF编码牵连蛋白[11]，peb1编码周质结合蛋白，它们均与细菌的黏附和侵入相关[12]，cheY编码调控鞭毛运动的调控子[13]， flaA也同样是重要的毒力相关因子，缺失这些基因后均导致细菌毒力显著降低[14]。毒力因子调查显示分离的鸽子源空肠弯曲杆菌G2-19、G2-31同样具有这些重要的毒力因子或毒力相关因子。基因序列分析发现，G2-19、G2-31的fliA和cdt毒素基因序列和C. jejuni M1高度相似。

Friis等[4]同时在人和家禽屠宰场中分离到C. jejuni M1菌株，为空肠弯曲杆菌的禽传人提供了直接的证据，全基因组测序后，与其他测序的空肠弯曲杆菌比对发现，该菌具有很多特异的鸡内定植相关的基因。本研究发现，鸽子中分离的空肠弯曲杆菌G2-19、G2-31与C. jejuni M1菌株毒力基因序列最为相似，暗示着该菌株也具有禽和人之间传播和交叉感染的能力，对人类的身体健康具有潜在的威胁。在后续的试验中将进一步通过动物试验研究分离的菌株对家禽和哺乳动物的致病性。

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