猴头菌中三种脂肪酸含量HPLCELSD测定方法的建立

建立猴头菌（Hericium erinaceus）子实体中棕榈油酸（palmitoleic acid）、异油酸（vaccenic acid）、软脂酸（palmitic acid）的高效液相色谱蒸发光散射检测（high performance liquid chromatographyevaporative lightscattering detector， HPLCELSD）方法。采用Grace Prevail Organic Acid 5 μm （250 mm×4.6 mm） 色谱柱[流动相为乙腈甲醇（80∶20），柱温30 ℃，流速1.0 mL/min]和ESA Chromachem蒸发光散射检测器[雾化温度（TNeb）35 ℃，蒸发温度（TEvap）50 ℃，衰减值（Attenuation）为3，载气为N2，操作气压为21 psi]，获得棕榈油酸、异油酸、软脂酸标准品的线性回归方程分别为Y=0.4982X +10.1120 （r=0.9998）、Y=0.8270X+9.7457 （r=0.9998）、Y=1.1316X +10.3790 （r=0.9997）；平均回收率分别为99.89%、100.68%和101.00%，RSD分别为1.26%、2.04%和1.72%。该方法可同时测定猴头菌中棕榈油酸、异油酸、软脂酸3种脂肪酸类化合物，且结果准确、重现性好、操作简便。

HPLCELSD； 猴头菌； 脂肪酸

猴头菌（Hericium erinaceus）又名猴头菇、猴头蘑、刺猬菌等，含有丰富的营养成分[1]，其中棕榈油酸、异油酸和软脂酸等多种脂肪酸总量占干品约3%[2]。脂肪酸类成分一直是近年来营养生化研究的热点，不饱和脂肪酸类成分在细胞膜功能调节[34]，抗心血管疾病[56]和生长发育的调节[78]等方面起着重要作用；而饱和脂肪酸类成分也是心血管疾病产生[9]和细胞凋亡[10]的重要诱因。然而现阶段对猴头菌研究主要还是集中在其多糖和甾醇类成分上，对其脂肪酸的研究较少。

脂肪酸类成分是一类不含生色团且紫外吸收不大的物质，传统的检测方法是将脂肪酸衍生为易挥发的脂化物，采用气相（GC）或气质联用（GCMS）法进行检测，然而衍生过程中存在的副反应和反应不完全的问题常常影响脂肪酸的检测；采用HPLC 配合紫外检测器、示差检测器和电化学检测器可直接检测脂肪酸及其衍生物，但无法采用梯度洗脱，从而一定程度上影响了上述方法的灵敏度和分离效果[1113]。高效液相色谱蒸发光散射检测（high performance liquid chromatographyevaporative lightscattering detector， HPLCELSD）是近年来兴起的一种检测技术，它适用于多种物质的检测，包括类脂、糖类、氨基酸、表面活性剂、高聚物等[14]。采用高效液相色谱蒸发光散射检测器检测脂肪酸类化合物时，脂肪酸不需要衍生的过程，并且洗脱条件可采用梯度洗脱。与其他方法相比，蒸发光检测物质时基线能够保持平稳且灵敏度高，具有分析时间短和方法简单的特点[1516]。

笔者进行研究，旨在建立猴头菌中棕榈油酸、异油酸、软脂酸等脂肪酸含量HPLCELSD测定方法，为食用菌中相关脂肪酸的检测提供参考。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器

棕榈油酸（palmitoleic acid）、异油酸（vaccenic acid）、软脂酸（palmitic acid）对照品批号分别为 U40AA2Y、U48AN13X、N16AMA14W，均来自NUCHEKPREP公司（美国）；石油醚（批号：201312012）为广州试剂厂产品；HPLC级乙腈（批号：1742630426）及HPLC级甲醇（批号：1744707429）均为德国默克股份两合公司产品。

高效液相色谱仪（Agilent 1200 series，Agilent公司，美国）、检测器（Chromachem蒸发光散射检测器，ESA公司，意大利）和N3000色谱数据工作站。

1.2试验材料

猴头菌（H. erinaceus）菌株ACE141436、ACM140178、ACW140461为广东省微生物研究所食用菌中心保存菌株。试验子实体为供试菌株按文献[17]方法栽培获得。

1.3检测方法

1.3.1色谱条件

色谱柱：Grace Prevail Organic Acid 5 μm （250 mm×4.6 mm）色谱柱，流动相为乙腈甲醇（80∶20），柱温30 ℃，流速为1.0 mL/min。检测器：ESA Chromachem蒸发光散射检测器，雾化温度（TNeb）35 ℃，蒸发温度（TEvap）50 ℃，衰减值（Attenuation）为3，载气为N2，操作气压为21 psi。

郑超群，等：猴头菌中三种脂肪酸含量HPLCELSD测定方法的建立

1.3.2样品溶液制备

猴头菌子实体干品用粉碎机粉碎，过40目筛，精密称取1.0 g，加入150 mL石油醚，索式提取6 h （85 ℃）。提取液置于通风厨内自然挥干，残留物加流动相溶解，并定容至5 mL量瓶中，摇匀，过0.22 μm滤膜，即得供试品溶液。

1.3.3混合对照品溶液制备

100 mL量瓶加入对照品棕榈油酸、异油酸、软脂酸和流动相乙腈甲醇（80∶20），得棕榈油酸、异油酸和软脂酸浓度分别为0.5、0.3 和0.2 mg/mL的混合溶液，即得所需混合对照品溶液。混合对照品及猴头菌供试品（ACW140461） HPLCELSD检测图谱如图1。

请亭亭把y轴改成 “响应值 Detector response”

图1 混合对照品（A）和猴头菌样品ACW140461（B）的HPLCELSD图

Fig.1 HPLCELSD chromatograms of mixed reference compounds （A） and sample ACW140461 （B）

1.4方法学考察

1.4.1线性关系考察

分别精密移取混合标准品溶液5.0、4.0、3.0、2.0、1.0和0.5 mL于10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，过0.22 μm滤膜，进样20 μL，每个浓度进样3次，记录色谱图数据。以进样量（μg）为X轴，3次进样峰面积积分值平均数的对数值为Y轴，分别进行线性回归分析。

1.4.2精密度试验

取1.3.3制作的混合对照品溶液，每次进样20 μL，重复进样6次。分别记录棕榈油酸、异油酸和软脂酸的峰面积，并计算RSD值。

1.4.3重复性试验

取1.3.2制备的同一供试品溶液6份，进样20 μL，记录样品中棕榈油酸、异油酸和软脂酸的峰面积，计算RSD值。

1.4.4稳定性试验

取1.3.2制备的样品溶液，室温放置0、2、4、8、12、24 h后，分别进样20 μL分析，记录棕榈油酸、异油酸和软脂酸的峰面积，并计算RSD值。

1.4.5加样回收率试验

取已知含量的样品平均分成6等份，按“1.3.2”方法制备供试品溶液，精密加入分别与样品中棕榈油酸、异油酸和软脂酸含量相等的对照品，再按“1.3.1”项下色谱条件测定，进样量为20 μL，测定峰面积，分别计算平均回收率和RSD。

1.5样品含量测定

取猴头菌子实体样品，按1.3.2法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样，分别测得棕榈酸、异油酸、软脂酸峰面积，通过标准曲线计算得3个样品中棕榈酸、异油酸、软脂酸的含量。

2 结果与分析

2.1线性关系考察

高效液相色谱蒸发光散射检测棕榈油酸、软脂酸及异油酸的回归方程及线性范围结果见表1。在试验质量浓度范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.2精密度、重复性和稳定性

混合对照品溶液重复进样6次，棕榈油酸、异油酸和软脂酸峰面积的RSD分别为1.41%、0.90%和1.46%，表明在此试验条件下精密度良好。6份同一供试品溶液测得的棕榈油酸、异油酸和软脂酸峰面积的RSD分别为1.33%、1.26%和1.36%，表明该方法重复性良好。6个不同放置时间的样品，测得的棕榈油酸、异油酸、软脂酸峰面积的RSD分别为1.10%、1.97%和1.79%，表明供试品溶液中棕榈油酸、异油酸和软脂酸在24 h内比较稳定。

2.3加样回收率试验

棕榈油酸、异油酸和软脂酸平均回收率为99.89%、100.68%和101.00%，RSD分别为1.26%、2.04%和1.72%（见表2）。表明该方法准确、可靠，可用于猴头菌中棕榈油酸、异油酸和软脂酸含量测定。

2.4样品脂肪酸含量测定结果

3个供试样品中脂肪酸含量测定结果见表3，不同菌株间脂肪酸含量差异较大，菌株ACW140461中3种脂肪酸含量皆最高，而ACM140178样品中异油酸的含量比其他两个样品低很多（P

3 讨论

流动相的选择中，曾尝试采用乙腈（A）甲醇（B）线性梯度洗脱（0～30 min， B%：20～40）和恒定比例流动相的乙腈∶甲醇（80∶20，70∶30，60∶40）等度洗脱，发现乙腈甲醇比例为80∶20时，供试品各峰的分离度较大，信噪比低，并且与梯度洗脱效果相当，综合考虑选定乙腈甲醇（80∶20）作为流动相等度洗脱；由于流动相都为有机溶剂（无水），且沸点

脂肪酸在食用菌中所占的比例较小，但与其他食品相比，其总脂肪酸中不饱和脂肪酸所占比例较高[18]。脂肪酸常用的定量检测方法主要为气相法和高效液相色谱示差检测器（HPLCRID）检测法[19]。气相法要求检测物质要有挥发性，所以待检测脂肪酸必须要经过衍生化转变成挥发性物质，该法误差较大[20]。HPLCRID检测法条件较苛刻，且灵敏度也相对较低[21]。HPLCELSD定量检测法的流动相采用等梯度洗脱，样品可直接检测，稳定、灵敏，且均能在15 min内完全出峰，并能同时测定猴头菌中棕榈油酸、异油酸和软脂酸3种脂肪酸类化合物。

本实验建立的猴头菌中3种脂肪酸含量HPLCELSD测定方法可用于猴头菌中棕榈油酸、异油酸、软脂酸含量的测定，具有结果准确、重现性好、操作简便、快速等优点，可为食用菌脂肪酸的研究提供一定的参考和借鉴。

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