时间：2022-08-17 03:09:05
摘要：主要比较了生产上常用的12个金针菇[Flammulina velutiper （Fr.） Sing.]菌株菌丝的生长速度及菌落特征，同时，对12个菌株的胞外酶，如羧甲基纤维素酶、木聚糖酶、漆酶的活力进行了测定，以期找出菌丝生长速度与胞外酶活力的相关性，为正确评价菌种质量提供科学依据。结果表明，12个菌株间菌丝生长速度存在差异，在PDA加富培养基上生长较快的菌株是9号和12号；在模拟出菇培养基上生长较快的菌株是7号、8号和12号。羧甲基纤维素酶活力最高的菌株是5号，木聚糖酶和漆酶活力最高的菌株是1号。胞外酶活力大小表现的顺序与生长速度偶联性较差。
关键词：金针菇[Flammulina velutiper （Fr.） Sing.]；生长速度；羧甲基纤维素酶；木聚糖酶；漆酶
中图分类号：S646.1+5∶Q55 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）22-5849-05
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.22.032
Study on the Hypha Growth Speed and Extracellular Enzymes Activity of 12 Strains of Flammulina velutiper
ZHAO Shu-ying1，WANG Li-an2
（1. College of Physical Education， Cangzhou Normal University， Cangzhou 061001， Hebei， China；
2. College of Life Science， Hebei Normal University， Shijiazhuang 050021， China）
Abstract： The hypha growth speed and colony characteristics of 12 stains of Flammulina velutiper （Fr.） Sing commonly used on the production was compared. Moreover， the activity of their extracellular enzymes， such as Carboxymethyl cellulose， xylanase， laccase enzyme were determined in order to find out the relationship between hypha growth rate and extracellular enzyme activity so as to provide scientific basis for evaluation of strain quality. The experimental results show that the growth speed of strain No.9 and No.12 was faster than the others on PDA medium with rich inorganic salts and vitamin； while the growth speed of strain No.7， No.8， and No.12 was faster than others on simulated mushroom medium. Carboxymethyl cellulase is the most active in strain No.5； while xylanase and laccase is the most active in strain No.1. The contingency between extracellular enzyme activity and speed coupling is poorer.
Key words： Flammulina velutiper （Fr.） Sing.； growth speed； CMC cellulose； xylanase； laccase
金菇[Flammulina velutiper（Fr.）Sing.]是味道鲜美、营养丰富的食用菌之一，同时又具有良好的保健价值，在国内许多地区都有栽培，金针菇产业的发展对促进当地经济和社会发展起到了重要推动作用。但在金针菇生产上也出现一些问题，一是所用金针菇菌种普遍退化、老化，造成菇农栽培风险加大，经济效益下滑；二是金针菇菌种市场极为混乱。由于目前食用菌菌种质量评价的科学体系还不完善，菌种质量和产销管理薄弱，一定程度上造成了食用菌菌种杂、多、乱的混乱现象，严重损害了菇农利益。为了解决以上问题，试验选择12个金针菇菌株为材料，通过测定胞外酶活力，试图建立快速评价菌种质量的检测体系，即找出胞外酶活力与生长速率的内在联系，从而建立不同菌株的酶活力数据库来评价菌种质量，为金针菇菌种质量保障提供技术支撑。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
12个不同金针菇菌株均为当地金针菇主栽菌种，现保存于河北师范大学生命科学学院实验室。具体编号为1号：白金F21；2号：金针FV093；3号：金针1008；4号：金科佳2041；5号：金针日金1号；6号：金F39；7号：金针1301；8号：金针2102；9号：三明B；10号：金杂19；11号：福建白金针；12号：三明C。
主要仪器有756MC紫外可见分光光度计、电热恒温水浴锅、恒温培养箱、超净工作台、电磁炉、电子分析天平、RE-5203旋转蒸发器、振荡器、78-1磁力加热搅拌器、立式自动电热蒸汽灭菌器等。
胞外酶活力测定的主要试剂有3，5-二硝基水杨酸（DNS，显色剂）、醋酸钠缓冲液（0.1 mol/L，pH 4.6）、邻联甲苯胺、木聚糖溶液，底物为1%的羧甲基纤维素钠溶液。
1.2 菌种培养
1.2.1 培养基 分别制作PDA培养基、PDA加富培养基、模拟出菇培养基。
1.2.2 不同菌株菌丝生长速度的测定 将4 ℃冰箱保存的试管母种分别接种到PDA加富培养基平板上，25 ℃下培养7 d后备用[1]。将活化的菌丝沿菌落的边缘用打孔器切下直径8 mm的菌块，分别接种于PDA加富培养基平板及模拟出菇培养基平板上，每个菌种3次重复，于25 ℃恒温培养箱内培养，2 d后每天定时精确测量菌落半径，同时观察记录菌株的菌落形态，按下式计算菌丝生长速度[2]，
菌丝生长速度（mm/d）=菌落半径（mm）/菌丝生长天数（d）。
1.3 胞外酶活力测定
1.3.1 酶液的制备 将在模拟出菇培养基上培养的菌落沿菌落边缘挖取发菌料各1 g于试管中，加入0.1 mol/L醋酸钠缓冲液10 mL（pH 4.6），4 ℃浸提4 h；将浸提液用滤纸过滤即得粗酶液。用于测定羧甲基纤维素酶、木聚糖酶、漆酶活力，测定时将各酶液稀释10倍[3]。
1.3.2 羧甲基纤维素酶活力测定 参考文献[4]的方法。①葡萄糖标准曲线的制备，准确称量0.1 g葡萄糖，加去离子水定容至100 mL，配成浓度为1 mg/mL的葡萄糖标准溶液，然后按照表1中不同的梯度进行稀释，制成梯度溶液。每试管分别取样2.5 mL，分别加2.5 mL DNS置于沸水浴5 min后显色，冷却后，于紫外可见分光光度计530 nm处测OD值。以OD值为纵坐标，葡萄糖质量为横坐标做标准曲线，求出回归方程。②羧甲基纤维素酶活力的测定，将1%的羧甲基纤维素钠溶液与稀释后的粗酶液在50 ℃预热1～2 min，在试管中依次加入预热后的2.0 mL 1%的羧甲基纤维素钠溶液和0.5 mL稀释后的粗酶液，50 ℃水浴30 min，取出后立即加入DNS试剂2.5 mL，100 ℃水浴中保温5 min，取出后用冷水冷却，于530 nm处测OD值，对照管加DNS试剂后再加相应酶液，每组设1个对照、2次重复。酶活力以样品与底物反应30 min后的光密度改变值表示。羧甲基纤维素酶活力单位定义为在50 ℃、pH 4.6条件下，反应30 min，每分钟每毫升羧甲基纤维素酶催化纤维素类物质水解生成1 μg葡萄糖的酶量定义为1 U。按下式计算酶活力，
羧甲基纤维素酶活力=N×葡萄糖的生成量/30/0.5×2.5，
式中，N为固体原料加水浸提所得的酶液稀释倍数，葡萄糖的生成量从标准曲线中查出，30表示酶促反应的时间（min）；0.5代表反应中加的酶量（mL）；2.5为反应的总体积（mL）。
1.3.3 木聚糖酶活力的测定 木聚糖酶活力为各菌株在模拟出菇培养基上生长第八天所测得，参考文献[5]的方法，先将pH 4.6的醋酸钠缓冲溶液、1%的木聚糖溶液及粗酶液于40 ℃预热1～2 min；然后在试管中依次加入pH 4.6的醋酸钠缓冲溶液1 mL、1%的木聚糖溶液0.5 mL、稀释后的粗酶液0.5 mL，40 ℃水浴30 min；取出后立即加入DNS试剂3 mL，100 ℃水浴中保温5 min，取出后用水冷却，于510 nm波长处测OD值。对照管加DNS试剂后再加相应的酶液，每组设1个对照、2次重复。酶活力以样品与底物反应30 min后吸光度的改变表示。木聚糖酶活力单位定义为在40 ℃、pH 4.6条件下，反应30 min，每分钟每毫升木聚糖酶催化底物产生0.1吸光度的变化为1 U。按下式计算木聚糖酶活力，
木聚糖酶活力=N×OD值/30/0.5/0.1，
式中，N为固体原料加水浸提所得的酶液稀释倍数；30表示酶促反应的时间（min）；0.5代表反应中加的酶量（mL）；0.1为吸光度的变化数值。
1.3.4 漆酶活力的测定 漆酶活力为各菌株在模拟出菇培养基上生长第八天所测得，参考文献[6]的方法，先将3.36 mmol/L邻联甲苯胺溶液、pH 4.6 的醋酸钠缓冲溶液及粗酶液于28 ℃预热1～2 min；然后往试管中依次加入3.36 mmol/L邻联甲苯胺溶液0.5 mL、pH 4.6的醋酸钠缓冲溶液3.5 mL、0.5 mL粗酶液，28 ℃保温30 min后，以煮沸灭活的酶液作对照，600 nm处测OD值，每组设1个对照、2次重复，酶活力以样品与底物反应30 min后吸光度值的改变表示。漆酶活力单位定义为在28 ℃、pH 4.6条件下，反应30 min，每分钟每毫升漆酶催化底物产生0.1个吸光度的变化为1 U。按下式计算漆酶活力，
漆酶活力=N×OD值/30/0.5/0.1，
式中，N楣烫逶料加水浸提所得的酶液稀释倍数；30表示酶促反应的时间（min）；0.5代表反应中加的酶量（mL）；0.1为吸光度的变化数值。
1.4 数据处理
试验所得数据采用Microsoft Office Excel 2003软件处理，并用其制表和绘图，运用SPSS 13.0统计分析软件进行方差分析和差异显著性检验。
2 结果与分析
2.1 12个金针菇菌株的菌丝生长特性比较
12个金针菇菌株在PDA加富培养基及模拟出菇培养基上的菌丝生长速度及生长状况测定结果分别见表2、图1、图2，在PDA加富培养基上的菌丝生长速度方差分析结果见表3，在模拟出菇培养基上的菌丝生长速度方差分析结果见表4。从表2、表3、表4、图1、图2分析可知，在PDA加富培养基上，12个金针菇菌株的菌丝生长速度可分为4组， A组有9号和12号菌株，B组含10号、7号、3号、11号、8号、5号，C组为1号；D组为6号、2号和4号，生长速度总体趋势为A>B>C>D。各组的方差分析结果表明，A组和B组菌丝生长速度之间无显著差异（P>0.05），同属生长较快的菌株；C组与B组菌丝生长速度相比无显著差异（P>0.05），但却显著低于A组（PD′>E′。各组的方差分析结果表明，A′组和B′组之间无显著差异（P>0.05），同属生长较快的菌株；C′组和B′组之间无显著差异（P>0.05），但要显著低于A′组（P0.05），但却显著慢于A′组和B′组（P
2.2 12个金针菇菌株的纤维素酶活力
2.2.1 葡萄糖标准曲线 以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，做葡萄糖标准曲线，结果见图3。从图3可以看出，吸光度在0.2～1.4时，与葡萄糖浓度呈线性关系。统计分析结果显示，在95%的置信区间内，其回归方程为y=0.008 1x-0.253 5，R2=0.998 425，说明可用于糖的测定。
2.2.2 12个金针菇菌株的羧甲基纤维素酶活力 12个金针菇菌株的羧甲基纤维素酶活力测定结果见表5、图4。由表5、图4可以看出，12个金针菇菌株的羧甲基纤维素酶活力由大到小的排序依次为5号、1号、7号、4号、9号、3号、8号、2号、12号、6号、10号、11号。以5号菌株的羧甲基纤维素酶活力最高，为175.41 U，与其他11个菌株的酶活力差异显著（P
2.3 12个金针菇菌株的木聚糖酶活力
12个金针菇菌株的木聚糖酶活力测定结果见表5、图5。由表5、图5可以看出，12个金针菇菌株的木聚糖酶活力由大到小的排序依次为1号、2号、12号、11号、9号、4号、3号、5号、7号、10号、6号、8号。以1号菌株的木聚糖酶活力最高，为3.60 U，除2号菌株外，与其他10个菌株的酶活力差异显著（P
2.4 12个金针菇菌株的漆酶活力
12个金针菇菌株的漆酶活力测定结果见表5、图6。由表5及图6可以看出，12个金针菇菌株的漆酶活力由大到小的排序依次为1号、2号、9号、4号、12号、6号、11号、8号、5号、7号、10号、3号。以1号菌株的漆酶活力最高，为3.39 U，与其他11个菌株的酶活力差异显著（P
3 小结与讨论
试验结果显示，12个金针菇菌株的菌丝生长速度在PDA加富培养基和模拟出菇培养基上基本是一致的，形态特征也无明显差异。在PDA加富培养基和模拟出菇培养基上均表现为生长较快的菌株有9号、12号、10号、7号、3号、8号、1号、5号、6号。所以可以用在PDA加富培养基上生长较快作为判断菌种吃料能力的评价指标。另外从反映菌株吃料能力的胞外酶活力测定情况看，羧甲基纤维素酶、木聚糖酶、漆酶活力均较高的菌株只有1号，并且其生长速度也较高，可判断为优良菌株；9号、12号各项指标也表现较好，也可视为优质菌种[7]。
试验的初衷是建立金针菇不同菌株的质量评价体系，所以搜集的菌种均为各地的高产主栽菌种。从试验结果可以看出，大多数金针菇菌株在PDA加富培养基和模拟出菇培养基上的生长速度均较快，说明参试菌株多数品质优良。此外，试验通过测定胞外酶活力试图建立快速评价菌种质量的检测体系，即找出胞外酶活力与生长速度的内在联系，通过建立不同菌株的酶活力数据库来评价菌种质量。但试验结果显示，还有很多问题需要进一步探讨，如有的菌株在2种培养基上的生长速度不一致，如11号在PDA加富培养基上生长的速度较快，但在模拟出菇培养基上生长最慢；还有就是胞外酶活力大小的顺序与生长速度偶联性较差，如2号菌株为生长速度较慢的菌株，但其木聚糖酶、漆酶的活力却较高。
为了克服误差，试验进行了多次重复，但仍存在这些问题。可能的原因一是参试的菌株菌龄不一致，由于参试材料来自各地，菌龄已无从查考。但一个明显的事实是菌株的生长速度与菌株的传代次数相关，传代次数越多，菌株生长能力越弱；菌株生长速度与菌株的适应能力也有关，从一种培养基到另一种培养基，菌株需要有一段适应时间，培养基成分相差越大，菌株生长速度就越慢。从试验结果看出，相同的菌株在不同的培养基上生长速度不同，不同的菌株在相同的培养基上生长速度也不同。整体上比较，菌株在PDA加富培养基上的生长速度高于在模拟出菇培养基上的生长速度。PDA加富培养基较模拟出菇培养基有更丰富的碳、氮源。为此，下一步的研究应注意采用相同菌龄的材料来对比。可采用先对参试材料进行品比试验，再采用组织分离方法重新分离菌种，以使菌龄达到一致。二是胞外酶属于诱导性酶，酶活性的高低与培养基的基质有关。为了比较不同菌株的吃料能力，试验采用了模拟出菇培养基测定3种胞外酶活力。羧甲基纤维素酶的作用是分解纤维素，木聚糖酶有分解半纤维素的能力，漆酶能催化木质素类的氧化酚类和芳香类化合物。试验采用的方法比一般的利用菌袋比较更利于在实验室培养及取材；但从酶活力结果看，结果并不理想。可能的原因是酶测定方法本身的误差造成，因在测定过程中参考有关文献方法时，发现酶活力数据漂移较大，如在测各种菌株漆酶的活力时，若将反应温度升高至50 ℃后，液体颜色为绿色，这与文献报道的产物为蓝绿色不同；怀疑为产物有所改变，故将测漆酶活力的温度固定为28 ℃。所以，建立稳定的、标准化酶活力检测方法将是下一步的重点。
参考文献：
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