猪饲料透析袋对猪消化系统的影响分析

本文作者：庄晓峰 张宏福 陈 亮 单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 动物营养学国家重点实验室

磷是动植物体内的必需矿物元素，是继蛋白质和能量之外的第三昂贵的饲料原料［1－4］。准确评定饲料有效磷含量是优化饲料配方、节约饲料资源和节能减排的重要基础和手段［5］。饲料磷生物学效价的评定方法主要有体内法和体外法。体内法试验条件难以控制，重复性差［6］，很难满足实践需求。而体外法具有快速、简便、费用低等优点，各国营养学家都有诸多研究报道。近年来，饲料磷的体外评定技术在国际上越来越受到关注，从而推动了相关研究的快速发展，其中以Zyla等［7］和Liu等［8］所建立的方法应用最为广泛。中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室于2009年成功研发一套具有自主知识产权的单胃动物仿生消化系统，并使用该仪器进行饲料原料及饲粮酶水解物总能的评定，但暂未开展仿生消化法测定饲料有效磷的相关研究。本试验利用SDS-Ⅰ仿生消化系统，采用仿生消化法测定猪饲料酶水解总能的操作规程，比较不同截留分子质量和不同来源的透析袋对仿生消化法评定饲料原料干物质和磷体外消化率的影响，为饲料磷生物学效价评定的仿生消化法操作规程的建立提供参考。

1材料与方法

1．1试验材料选用玉米、豆粕、麦麸3种猪常用饲料原料，其磷营养含量如表1所示，粉碎过40目筛后，－20℃储存备用;美国Viskase进口分装截留分子质量分别为14000、7000、3500u的透析袋购自北京经科宏达;美国光谱医学进口分装截留分子质量分别为3500、1000u的透析袋购自上海生工生物。

1．2试验设计试验采用单因素完全随机试验设计，选用美国Viskase截留分子质量分别为14000、7000、3500u以及美国光谱医学截留分子质量分别为3500和1000u的5种透析袋，采用仿生消化法评定猪饲料干物质消化率的操作规程［9］，通过测定消化残渣总磷含量，评定玉米、豆粕、麦麸干物质和磷的体外消化率，每个样品5个重复。

1．3透析袋的处理因美国Viskase透析袋中含有少量硫化物及重金属离子，使用前需进行如下处理:将透析袋剪成25cm左右的小段，在pH8．0的2%碳酸氢钠(NaHCO3)、1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)溶液中煮沸10min，然后立刻用去离子水冷却并清洗;再将透析袋放在pH8．0的1mmol/LEDTA的溶液中煮沸10min;待溶液冷却后，透析袋直接浸泡在EDTA溶液中4℃保存。从此时起取用透析袋必须戴手套。透析袋使用前用去离子水冲洗3次，将之清洗干净。美国光谱医学透析袋出厂前已预处理过，基本不含硫化物和重金属离子，使用前只需要用去离子水冲洗3次即可。

1．4缓冲溶液的配制在39℃下配制pH2．0的盐酸溶液作为胃阶段的透析液;配制pH6．44的乙酸－乙酸钠缓冲溶液作为小肠阶段透析液，并加入160×104U青霉素钾防止微生物的生长。

1．5仿生消化系统操作过程仪器使用前，首先使用0．05mol/L的氢氧化钾(KOH)溶液清洗1遍，然后用去离子水清洗2遍，最后排空管道积水，完成清洗过程。在仪器清洗的同时把2个阶段pH分别为2．0和6．44的缓冲溶液放入仿生消化系统的39℃水浴锅中进行预热。与此同时，将处理好的透析袋装入仿生消化管中，并将一端用硅胶塞密封。将称样管中的饲料样品(1．0000±0．0002)g用20mL1475．0U/mL胃蛋白酶(SigmaP7000)溶液(pH2．0、39℃)无损失地转移至透析袋中，并将消化管的另一端也塞上带加酶器的硅胶塞子。把消化管装在仿生消化系统上，连接好消化管道。设置好仪器的消化参数，运行仿生消化系统胃期(消化时间4h)的消化。胃阶段消化结束后，仪器会自动使用小肠期的乙酸－乙酸钠缓冲溶液润洗透析袋30min，调节透析袋内消化液pH为6．44，此时仪器处于暂停待加酶的状态。通过加酶器在每个消化管中加入2mL小肠期模拟消化酶，使消化液中含69．10U/mL胰蛋白酶(Amresco)、8．68U/mL糜蛋白酶(Amresco)、221．43U/mL淀粉酶(Sig-ma)，继续进行小肠期(消化时间16h)消化。待样品消化结束后，取出消化管，按照清洗程序对仪器管道进行清洗。同时用去离子水将透析袋中的消化液和残渣无损失地转移至已恒重(M1)的150mL的烧杯中，在65℃条件下烘至无水痕后，105℃烘至恒重(M2)，测定残渣总磷含量(P2)［10］。

1．6干物质和总磷消化率的计算干物质消化率(DMD，%)=100×［M0×DM0－(M2－M1)］/(M0×DM0);总磷消化率(PD，%)=100×(M0×DM0×P1－P2)/(M0×DM0×P1)。式中，M0:饲料样品重(g);DM0:饲料样品干物质含量(%);M1:烧杯绝干重(g);M2:烧杯+残渣绝干重(g);P1:饲料样品磷含量(%，绝干基础);P2:消化残渣总磷含量(g)。

1．7数据处理数据用SAS8．0的MEANS模块对基本统计量进行分析，按平均值±标准差表示;按单因素完全随机试验设计，采用GLM模块对数据进行方差分析，用Duncan氏法进行多重比较，P＜0．05为显著水平。

2结果

2．1不同截留分子质量的美国Viskase透析袋对猪饲料原料干物质和磷体外消化率的影响由表2可知，采用不同截留分子质量的美国Viskase透析袋，玉米、豆粕、麦麸3种饲料原料的干物质和磷体外消化率测定结果存在显著差异(P＜0．05)。在干物质消化率方面，截留分子质量为3500u的透析袋测得的玉米、豆粕、麦麸消化率与截留分子质量为7000u的透析袋相比，分别降低了15．83%、9．47%、8．51%(P＜0．05);截留分子质量为7000u的透析袋测得玉米、麦麸干物质消化率分别比截留分子质量为14000u的透析袋降低了3．04%和2．08%(P＜0．05)，而豆粕干物质消化率两者之间无显著差异(P＞0．05)。在磷消化率方面，截留分子质量为3500u的透析袋测得的玉米、豆粕、麦麸磷消化率比截留分子质量为7000u的透析袋分别降低了22．97%、18．39%、12．32%(P＜0．05);截留分子质量为7000u的透析袋测得的玉米、豆粕、麦麸磷消化率比截留分子质量为14000u的透析袋分别降低了9．12%、1．56%、4．50%(P＜0．05)。结果表明，在本试验条件下，随着透析袋截留分子质量减小，饲料原料干物质和总磷消化率逐渐降低。

2．2不同截留分子质量的美国光谱医学透析袋对猪饲料原料干物质和磷体外消化率的影响由表3可知，采用不同截留分子质量的美国光谱医学透析袋测得的饲料原料干物质和磷体外消化率存在差异。截留分子质量为1000u的透析袋测得的玉米、麦麸干物质消化率显著低于截留分子质量为3500u的透析袋(P＜0．05)，分别降低1．61%、3．35%，而豆粕干物质消化率无显著差异(P＞0．05)。截留分子质量为1000u的透析袋测得的麦麸磷消化率显著低于截留分子质量为3500u的透析袋(P＜0．05)，降低0．63%;豆粕磷消化率显著高于分子质量为3500u的透析袋(P＜0．05)，升高1．67%;玉米磷消化率之间无显著差异(P＞0．05)。在本试验条件下，美国光谱医学截留分子质量为3500和1000u的透析袋测得的饲料原料干物质和磷体外消化率没有明显的规律性。

2．3不同来源的透析袋对猪饲料原料干物质和磷体外消化率的影响从表4可知，采用相同截留分子质量(3500u)的透析袋，美国Viskase透析袋测得的饲料原料干物质和磷消化率均显著低于美国光谱医学透析袋(P＜0．05)，玉米、豆粕、麦麸干物质消化率分别降低了17．77%、9．74%、10．53%，磷消化率分别降低了27．98%、21．10%、16．97%。在本试验条件下，使用相同截留分子质量的不同来源的透析袋，测得饲料原料干物质和磷消化率存在显著差异(P＜0．05)。

3讨论

3．1不同截留分子质量透析袋对仿生消化法评定猪饲料原料干物质体外消化率的影响透析袋截留分子质量对体外养分消化率的影响较大。Drake等［11］和张铁鹰［12］研究表明，当采用截留分子质量大的透析袋时，粗蛋白质和淀粉的消化率均高于截留分子质量小的透析袋。本试验采用美国Viskase不同截留分子质量的透析袋，利用仿生消化系统测定了玉米、豆粕、麦麸的干物质消化率，结果也表明随着透析袋截留分子质量即孔径的缩小，饲料原料干物质消化率呈现下降的趋势。同时，本试验用美国Viskase截留分子质量为14000u的透析袋测得的干物质消化率显著高于截留分子质量为7000和3500u的透析袋的结果也表明了饲料养分在体外消化条件下大部分仍是以大分子物质的形式存在［12］。而美国光谱医学不同截留分子质量透析袋测得豆粕干物质消化率无显著差异，玉米、麦麸干物质消化率仅相差1．61%、3．35%。且美国光谱医学截留分子质量为3500u的透析袋测得的结果显著高于美国Viskase截留分子质量为3500u的透析袋，而与美国Viskase截留分子质量为14000u的透析袋测定结果接近。理论上透析袋截留分子质量越小，透析袋的孔径越小，可透析到缓冲溶液中的小分子物质越少，因此透析袋截留分子质量越小饲料干物质消化率应该越低。而从本试验结果可知，不同来源的透析袋可能由于本身制作工艺的差别及对试验条件的敏感性，测定结果存在较大差别。对于干物质及蛋白质的体外消化采用何种截留分子质量的透析袋仍存在不同观点。Gauthier1530等［13］认为，在蛋白质的体外消化模拟中，采用截留分子质量为1000u的透析袋较为合理，该透析袋孔径恰好能够使氨基酸和短肽(2～6个氨基酸)通过，与体内吸收的氨基酸和短肽的分子质量大小相当，符合体内消化吸收机理。Drake等［11］、张铁鹰［12］、黄瑞林等［14］及袁旭鹏等［15］关于蛋白质或干物质的体外消化研究中，均认为采用截留分子质量为12000～14000u的透析袋可行。体外模拟消化装置中缺乏将养分水解成可吸收形式的肠肽酶和二糖酶等消化酶，如果采用截留分子质量较小的透析袋，则会将一些在体内可吸收的养分认定为不可吸收成分。结合本试验结果，由于饲料养分在体外消化过程中大部分仍是以大分子物质的形式存在，采用截留分子质量较大(12000～14000u)的透析袋可能更适合于仿生消化法评定饲料原料干物质消化率的要求。

3．2不同截留分子质量透析袋对仿生消化法评定猪饲料原料磷体外消化率的影响与饲料干物质的仿生消化不同，按照仿生法测定饲料干物质消化率的操作规程，磷的体外消化模拟需要通过缩小透析袋孔径以达到无机磷与有机磷的分离，从而预测饲料磷的消化率。植物性饲料中的磷以无机磷和有机磷(主要是植酸磷)2种形式存在。植酸即六磷酸肌醇，是由1分子肌醇和6分子磷酸组合而成，分子式为C6H18O24P6，相对分子质量为660．08。以无机盐形式存在的磷在消化道溶解后可直接被动物吸收利用，而以有机化合物形式存在的磷必须经酶水解释放出无机磷后才能被动物吸收利用［16］。植酸在植物体内一般不以游离形式存在，根据其分子结构，植酸含有12个可解离的质子，这些位点可以与钙、镁、钾、锌、铁等金属离子结合，以复合盐类或单盐的形式存在，此外它还可以与蛋白质、氨基酸、淀粉和脂质等物质上的阳离子基团结合，以植酸复合物的形式存在。本试验采用仿生消化法评定饲料干物质消化率的操作规程，选用不同截留分子质量的美国Viskase、光谱医学透析袋，通过测定消化残渣总磷含量，评定了玉米、豆粕、麦麸磷的体外消化率。结果表明，随着透析袋孔径的缩小，美国Viskase透析袋测得的饲料原料磷消化率逐渐降低，与干物质消化率的变化趋势一致，可见部分植酸磷随着蛋白质、淀粉等消化分解后的小分子物质通过了透析袋。美国Viskase截留分子质量为3500u的透析袋所测得的玉米、豆粕、麦麸磷消化率最低分别为55．46%、55．53%和75．66%。2种截留分子质量(3500和1000u)的美国光谱医学透析袋所测饲料磷消化率存在差异，但消化率最大仅相差1．67%，不排除由于误差原因导致测定结果差异显著。截留分子质量为3500u的美国光谱医学透析袋测得的饲料原料磷消化率显著高于美国Viskase的透析袋。目前市场上销售的美国Viskase透析袋最小截留分子质量为3500u，而光谱医学透析袋可能受本试验的某一条件的影响，测定结果与理论推理相违背。对猪而言，除小麦中磷的利用率可达到约50%外，其他植物性饲料原料磷的利用率在10%到30%［17］。本试验中美国Viskase截留分子质量为3500u的透析袋测得的玉米、豆粕、麦麸总磷消化率最低，分别为55．46%、55．53%和75．66%，最接近于贾刚等［18］及方热军［19］的体内测定结果。而美国Viskase截留分子质量为3500u的透析袋是否能完全截留饲料原料中的有机磷，还需要进一步的研究验证。

4总结

①体外模拟消化无法完全模拟动物消化道的多酶系统，部分体内可消化吸收养分在体外模拟消化环境下仍以大分子物质形式存在，因此截留分子质量为14000u的透析袋更适宜于仿生法干物质消化率的评定。②美国光谱医学透析袋可能由于材质方面对试验条件的敏感性，测得磷消化率没有明显规律性;美国Viskase截留分子质量为3500u的透析袋测定结果最接近磷体内消化值，但该孔径下利用仿生消化系统是否能将饲料中有机磷分离出去，还需要进一步的研究。