对于微生物研究及探讨

摘要：目前感染性疾病仍然是危害人类健康的重大隐患。随着新发和突发感染性疾病的涌现，曾已被控制的感染性疾病的卷土重来，造成感染性疾病的微生物种类日益复杂，常见的病原微生物的威胁不仅没有消除而且出现了大量耐药菌株，加上新的病原微生物的出现，给临床诊断和治疗带来了极大的困扰。严峻的现实给病原微生物的检测和诊断提出了更高的要求。世界卫生组织(WHO)对临床微生物实验室提出:临床微生物实验室尽可能把目标集中在快速诊断方面。利用一切手段将实验室数据转化为临床有用的信息。

关键词：病原微生物 分子生物 诊断技术

【中图分类号】R4【文献标识码】A【文章编号】1008-1879(2012)02-0027-01

1 自动化鉴定技术的应用

临床微生物的实验室检查以染色、培养、生化鉴定等为主，尤其是分离培养，目前仍然是许多病原体检测的“金标准”。但是，由于细菌的生长繁殖需要一定时间，使检测周期难以缩短。此外，很多病原体的培养受营养要求、抗生素应用及病原体含量等因素的影响，用传统人工方法操作复杂、检测周期长，敏感性与特异性也有限。为解决这一问题，各种自动化培养和鉴定系统不断产生，随着计算机的发展和应用，先后出现了许多自动与半自动细菌鉴定与药敏系统，统称为“微生物鉴定专家系统”，这些系统大大提高了临床实验室的工作效率和检测的准确性，传统鉴定方法也在逐步改进，并在一定程度内加快了检测速度。

2 免疫学方法

免疫学技术是利用特异性抗原抗体反应，检测病原微生物，简化了病原微生物的鉴定步骤，备受关注。各大文献数据库提供的数据显示，几乎建立了所有病原体的血清学检测方法，表明该方法已成为一种微生物实验室常用的成熟的检测技术。

2.1 凝集技术常用的凝集技术有乳胶凝集技术和血清凝集技术。用于微生物的初步诊断、分型、鉴定，例如霍乱弧菌和志贺菌的分型，大肠杆菌O157：H7、脑膜炎球菌等，短时间内就可完成鉴定。该诊断法具有操作简便、快速、准确、特异性强、阳性率高等特点。

2.2 荧光抗体技术荧光抗体技术是根据抗原抗体反应具有高度的特异性，把荧光素作为抗原标记物，在荧光显微镜下检查呈现荧光的特异性抗原抗体复合物及其存在部位。荧光抗体技术的主要特点是特异性强、速度快。吕治林等报道由美国同行所作的用炭疽杆菌细胞壁(CW-DFA)和荚膜抗原(CAP-DFA)特异的荧光标记的单克隆抗体，可快速鉴别炭疽杆菌。

2.3 酶免疫技术酶联免疫技术现已被广泛地应用于多种病原微生物的检测，可检测样本中病原体抗原，也可检测机体中的抗体成分。应用单克隆抗体结合硝酸纤维膜上的斑点ELISA技术，已成功地自患者的咽拭标本中同时检出可能存在的肺炎支原体、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒。Gehring等用酶联免疫化学发光法(ELIMCL)测定大肠杆菌O157：H7。许多疾病的检测都已有商品化的试剂盒出现。

3 分子生物学技术

随着分子生物学技术的迅速发展，使人们对微生物的认识从外部表型逐渐转向内部基因结构特征，微生物的检测也从生化、免疫方法转向基因水平检测，对于那些难培养和不可能培养的微生物，可直接通过获得基因信息，给微生物学的检测带来崭新的领域，为科学快速发展提供了新的机遇。

3.1 PCR技术PCR具有高度敏感性和特异性，在病原体检测上，对形态和生化反应不典型的微生物鉴定，常规方法常难以准确检测，即使出现大量死菌PCR也能做出准确的鉴定；不受混合标本的影响，可轻易从含有大量正常菌群的标本中鉴定病原菌；对于生长缓慢或难于培养的微生物鉴定，如分枝杆菌、幽门螺杆菌、支原体、衣原体、螺旋体等，目前其他方法阳性检出率很低，PCR技术对这类菌株的鉴定有重要意义。但是常规PCR技术也存在一些问题，如出现假阳性、形成引物二聚体，检测操作也比较繁琐，中间污染环节多，易出现假阳性或假阴性结果。为了克服这些不足，一些新的PCR技术渐衍生出来并被用于实践，如巢式PCR、逆转录PCR、多重PCR、通用引物PCR(UP-PCR)、PCR单链构象多态性分析、随机引物DNA多态性扩增(RAPD)、限制性长度多态性分析(RFLP)、实时荧光定量PCR等。

3.2 基于16S rRNA与GyaB的检测技术。

3.2.1 以16S rRNA为靶基因进行检测16S rRNA存在于所有原核生物细胞中，它们相对稳定且有较高的拷贝数，其序列中含可变区及高度保守区，因此可设计群、属、种特异性的探针。现阶段各种常见细菌的16S rRNA基因几乎全部测序完成，16SrRNA编码基因的这些特点使之成为较理想的细菌基因分类的靶序列，逐渐成为细菌鉴定、分类的“金标准”。

3.2.2 以促旋酶(gyrase)B亚单位基因靶基因进行检测GyaB除了具有16S rRNA所具有的优点外，其基因进化率高于核糖体基因，还有GyaB在近乎全部细菌中呈单拷贝形式。有研究表明，基于GyaB序列构建的进化图谱与基于DNA-DNA杂交的相一致。因此，GyaB的分析特别适合于菌株的区别和鉴定。Fukushima等以GyaB基因为靶基因设计基因芯片来检测分枝杆菌属，实验结果显示此芯片鉴别分枝杆菌达到种水平，并且能区别密切相关的菌种，这对临床治疗具有重要的参考价值，说明分析GyaB基因序列对于在菌种水平鉴别细菌是快速而有效的方法。

3.3 多位点序列分型多位点序列分型(MLST)是近年来发展很快的分子生物学分析方法，具有很高的分辨能力，既适于分子流行病学研究，也可用于分子进化学的研究。MLST越来越多地被作为能进行国际间菌株比较的常用工具，建立一种更为准确的分析系统方法，并且用于研究出现的不同的抗生素抵抗株，相关特殊基因型及新的变异株引起的疾病流行病学分析和种群结构的研究。

参考文献

［1］ 毕春霞,闫志勇,王斌.病原微生物临床检验技术进展［J］.青岛大学医学院学报,2005,41(4):369-371

［2］ Nunes AA,Camargos PA,Costa PR,et al.Antigen detection for the diagnosis of pneumonia［J］.Pediatr Pulmonol,2004,38(2):135

［3］ 吕治林,闻怡笑.病原微生物快速检测方法及研究进展［J］.国外医学:流行病学传染病学分册,2003,1(30):58