DPI对尾叶桉愈伤组织诱导和抗氧化酶活性的影响

摘要：将不同浓度DPI添加到尾叶桉（Eucalyptus urophylla）愈伤组织诱导培养基中，分析DPI对其愈伤组织诱导和SOD、POD、CAT、APX 4种抗氧化酶活性的影响。结果表明，高于1.5 μmol/L的DPI显著抑制尾叶桉愈伤组织的诱导，0～0.25 μmol/L的DPI能减轻褐化，0.1 μmol/L DPI抗褐化效果最好，褐化率仅9.82%。0～0.25 μmol/L的DPI处理后，尾叶桉APX活性随DPI浓度升高而升高，SOD、POD、CAT活性随DPI浓度升高呈先升高后降低的趋势。添加0.10 μmol/L DPI可提高保护酶活性，减轻褐化，促进尾叶桉愈伤组织诱导。

关键词：尾叶桉（Eucalyptus urophylla）；DPI；愈伤组织诱导；抗氧化酶

中图分类号：S792.39 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）11-2153-04

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2017.11.040

Abstract： The callus of Eucalyptus urophylla was induced by adding different concentrations of diphenyleneiodonium（DPI） to the callus induction medium. And SOD，POD，CAT and APX activities of the callus were measured. The concentration of DPI higher than 1.5 μmol/L significantly inhibited callus induction. 0～0.25 μmol/L DPI can reduce browning，of which 0.1 μmol/L concentration can get the best anti-browning effect，browning rate only 9.82%. In the DPI treatment of 0～0.25 μmol/L，the activity of APX increased，while the activities of SOD，POD and CAT increased first and then decreased with the increase of DPI concentration. The results showed that addition of 0.10 μmol/L DPI could promote the callus of Eucalyptus urophylla induction by increasing the protective enzyme activity and reducing the browning.

Key words： Eucalyptus urophylla；DPI；callus induction；antioxidase

尾~桉（Eucalyptus urophylla）为桃金娘科（Myraceae）桉属（Eucalyptus）植物，原产于印尼，中国1976年开始引种[1]。尾叶桉U6无性系具有抗病、抗风、速生、易繁殖、萌芽力强、综合性能好、实用性强等优点，深受各地林农的喜爱，已成为营造桉树速生丰产造林的主要树种之一[2]。桉树是世界上主要产材树种之一，其人工造林占世界人工造林的五分之一，桉树组织培养是林木组织培养研究最早、最多的一大类，目前全世界已对60种桉树进行了组织培养技术的研究[3]。

二苯基氯化碘盐（Diphenyleneiodonium chloride，DPI）是植物NADPH氧化酶的专一性抑制剂。ROS主要发生于质膜上的氧化还原系统，质膜NADPH氧化酶是此系统产生活性氧的主要功能蛋白质[4，5]。DPI能够通过结合到NADPH氧化酶的两个氧化还原元件上抑制其活性[6]。ROS的过度积累会引起植物细胞膜系统等细胞结构的氧化损伤，而生物膜的完整性和渗透性是外植体褐化的重要因素之一[7]。研究表明，DPI能影响植物根的伸长、气孔开闭等[6，8]。本研究通过向尾叶桉愈伤组织诱导培养基中添加不同浓度的DPI，探究DPI对尾叶桉愈伤组织诱导及其对抗氧化酶活性的影响，以期为桉树组织培养研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

尾叶桉种子由国家林业局桉树中心提供。

1.2 方法

1.2.1 尾叶桉无菌苗的培养 将尾叶桉种子在1%Triton X-100溶液中浸泡1 h后用无菌水漂洗1次，再用70%的乙醇表面消毒45 s，用无菌水漂洗2次，清除残留乙醇。再用20%的次氯酸钠溶液消毒7 min，期间轻轻摇动三角瓶以提高灭菌效果。用无菌水漂洗4次后，再用20%的次氯酸钠溶液浸泡7 min，用无菌水漂洗6～8次后，将种子播种于播种培养基（1/2MS+蔗糖20 g/L+琼脂7.5 g/L，pH 5.8～6.0），置于25 ℃暗处萌发。

1.2.2 尾叶桉愈伤组织的诱导 将高3～5 cm、仅含1对子叶、苗龄为8 d的无菌苗取出，置于16 h光/8 h暗光周期、光照度为50 μmol/m・s、温度（25±2） ℃的人工气候箱中光处理2 d后，切取8 mm长的下胚轴切段为外植体，接种于添加了不同梯度浓度DPI的诱导培养基（1/2MS+10 g/L蔗糖+7.5 g/L琼脂+100 mg/L 维生素C+0.57 μmol/L 6-BA+0.57 μmol/L IAA+3.99 μmol/L PBU，pH 5.8～6.0），置于（25±2） ℃暗处培养2周，然后转移至16 h光/8 h暗光周期、光照度50 μmol/m・s、温度（25±2） ℃的人工气候箱继续培养6周。

1.2.3 愈伤生长情况统计 每个试验处理均设置3次重复，每次重复接种3个培养皿，每个培养皿接种约10个外植体。外植体愈伤组织以切口基部能观察到球状突起，即生长出直径大于2 mm的愈伤组织计数，愈伤组织诱导率为诱导出愈伤组织的外植体数占接种外植体数的百分比[9]。褐化外植体以通体为褐色或黑色，即肉眼不可见明显白色、黄色、绿色组织块的外植体计数，外植体褐化率为褐化外植体数占接种外植体数的百分比。

诱导率=（诱导出的愈伤组织块数/总外植体数）×100%

褐化率=（褐色外植体数/总外植体数）×100%

1.2.4 抗氧化酶酶活性测定方法

1）酶液的制备：取梯度浓度的绿色愈伤组织 0.5 g于预冷的小研钵中，加入20 mg PVP和6 mL预冷的0.1 mol/L pH 6.9磷酸缓冲液（PBS）冰浴匀浆，4 ℃，8 000 r/min离心10 min，所得上清即为待测酶液。

2）考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，用牛血清白蛋白作标准曲线，由标准曲线方程计算酶液的蛋白质浓度。

3）四氮唑蓝（NBT）光化原法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性：参考邹琦[10]的方法测定。3 mL反应混合液含0.05 mL酶液、13 mmol/L Met、75 μmol/L NBT、10 μmol/L EDTA-Na2、2 μmol/L核黄素、5 mmol/L PBS（pH 7.8）、0.25 mL去离子水，在4 000 lx光照下反应20 min。以不照光为空白对照，对照管以PBS代替酶液。在560 nm下测定试验组的吸光度，SOD活性单位是以抑制NBT光化还原的50%作为1个酶活性单位。

4）愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性：参考张志良等[11]的方法，略有改进。100 mmol/L PBS（pH 6.0）100 mL，加入愈创木酚56 μL，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢38 μL配制成反应混合液，混合均匀后装到棕色瓶中4 ℃保存。对照组加入反应混合液3 mL和1 mL PBS作为校零对照，试验组加入反应混合液3 mL、20 μL酶液、980 μL PBS。立即于470 nm波长下测定，每隔1 min读数1次，共测4 min，以每分钟A470 nm变化0.01为1个活力单位（U），计算出POD活性。

5）抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性：参考邹琦[10]的方法测定，略有改进。3 mL反应混合液中含50 mmol/L PBS（pH 7.0）、0.1 mmol/L EDTA-Na2、0.3 mmol/L ASA、0.2 mmol/L H2O2和酶液0.1 mL。加入H2O2后立即在20 ℃下3 min内每30 s测定1次A290 nm值变化，计算单位时间ASA减少量得到APX活性。

6）紫外吸收法测定过氧化氢酶（CAT）活性：参考Aebi[12]的方法测定，略有改进。3 mL的反应体系为1.5 mL 100 mmol/L PBS，1.18 mL去离子水，试验组加20 μL预热的酶液，对照加20 μL煮沸的酶液，再加0.3 mL 150 mmol/L H2O2。加入H2O2后立即在240 nm下测定其吸光度，每隔1 min读数1次，共测4 min，以每分钟内A240 nm变化0.01作为1个酶活单位（U），计算CAT活性。

2 结果与分析

2.1 不同浓度DPI处理对尾叶桉愈伤组织诱导率的影响

由表1可知，以没有添加DPI处理为对照组，对照组的愈伤组织诱导率为98.14%。低浓度DPI处理（0.50、1.00 μmol/L）尾叶桉愈伤组织诱导率与对照没有显著差异，愈伤组织细胞分裂旺盛，膨大良好；当DPI处理浓度超过1.50 μmol/L时，DPI对尾叶桉愈伤组织诱导表现出明显的抑制作用，愈伤组织诱导率84.41%，愈伤组织细胞分裂正常，膨大体积相对较小；当DPI处理浓度超过2.50 μmol/L时，DPI对尾叶桉愈伤组织诱导表现出强烈的抑制作用，愈伤组织诱导率9.34%，外植体不膨大或仅两端略微膨大，体积很小。

2.2 不同浓度DPI对尾叶桉愈伤褐化率的影响

由表2可知，一定浓度的DPI处理能减轻尾叶桉愈伤组织在培养过程中的褐化程度，在0.10 μmol/L DPI处理时，对抑制尾叶桉愈伤组织褐化的效果最好，可以观察到诱导出的绿色尾叶桉愈伤组织比例较高，呈浅绿色至翠绿色，愈伤组织块表面有多个可见颗粒，颗粒内可见明显芽点。

2.3 不同浓度DPI对尾叶桉愈伤抗氧化酶活性的影响

由表3可知，一定浓度的DPI可以提高尾叶桉愈伤组织的抗氧化酶活性。添加终浓度为0.05～0.25 μmol/L的DPI处理尾叶桉愈伤组织诱导培养基时，抗坏血酸过氧化物酶（APX）随着DPI处理浓度的升高而升高。超氧化物岐化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）均表现出随着DPI处理浓度的升高，酶活性先升高后下降，活性最高点分别位于0.05、0.15和0.10 μmol/L。而这3个DPI处理浓度对应的褐化率分别为11.84%、9.82%、10.88%，褐化率较低。由此可以推断，DPI对尾叶桉愈伤组织的抗褐化作用与提高抗氧化酶活性有关。

3 小结与讨论

活性氧ROS包括超氧化物、H2O2、单线态氧和羟自由基等。外植体在切伤刺激和离体培养条件的胁迫下，ROS过度积累。ROS以其极强的氧化性造成细胞膜脂过氧化反应，损伤膜系统，导致外植体褐化。DPI是NADPH氧化酶的特异性抑制剂，能通过抑制NADPH氧化酶的活性进而抑制ROS的形成。

植物的抗氧化系统由抗氧化酶类和抗氧化物质即抗氧化剂类组成。抗氧化酶类包括超氧化物岐化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、过氧化物酶（POD）以及抗坏血酸（AsA）-谷胱甘肽（GsH）循环酶类等[13]。植物的抗氧化酶防御系统和抗氧化剂防御系统通过协同作用清除ROS进而调控过度的氧化级联反应和保护植物细胞[14]。

通过测定尾叶桉愈伤组织SOD、POD、CAT、APX 4种抗氧化酶活性，发现一定浓度的DPI对尾叶桉愈伤组织这4种抗氧化酶活性均具有显著提高的作用。SOD、CAT、POD是抗氧化酶系统中控制植物体内活性氧积累的最主要酶，SOD能清除细胞中多余的超氧阴离子，CAT和POD可以使H2O2歧化成无毒害的水和氧分子[15]，而APX是叶绿体专一清除H2O2的关键酶[13]。抗氧化酶活性的提高有利于减缓愈伤组织活性氧对细胞的氧化损害，减缓其细胞膜质过氧化并抑制褐化[16]。但也有研究表明，POD催化H2O2氧化酚类物质，在植物愈伤组织褐化过程中起重要作用[17]。这说明POD对愈伤组织的作用具有两重性，抗氧化酶对愈伤组织的作用及机制需要进一步研究。

抗褐化剂在一定的适用浓度范围起作用，超过这个适用浓度范围通常会引起负效应的发生[18]。ROS影响着植物许多基因的表达，包括控制生长、细胞周期、细胞程序性死亡、非生物胁迫反应、病原体防御、全身信号转导和发育等[14]。NADPH氧化酶产生的ROS可以激活Ca2+通道使细胞外的Ca2+向细胞内流动，从而保证细胞生长所必须的Ca2+，进而调节植物细胞生长[8]。ROS对于植物体重要的生物学意义已经引起科学家的广泛关注。本试验发现在尾叶桉愈伤组织诱导培养基中添加高浓度的DPI时，对外植体产生极大的毒害作用，愈伤组织诱导率显著降低。原因可能是添加高浓度的DPI过度抑制了NADPH氧化酶活性，减少ROS生成的同时，又提高具有ROS清除能力的抗氧化酶活性，导致外植体体内ROS不足，进而影响外植体细胞的生长与增殖。

就保持细胞膜系统完整性而言，在组培过程中多余的ROS对细胞膜的氧化损伤是有害的，DPI是质膜NADPH氧化酶的特异抑制剂，能抑制ROS的产生，而本试验也发现DPI能增强尾叶桉愈伤组织抗氧化酶SOD、POD、CAT、APX的活性，增强ROS的清除能力，虽然目前尚未明确DPI对这4种抗氧化酶活性的作用机制，但使用DPI通过控制尾叶桉愈伤组织ROS的积累量，减轻细胞膜损伤并进一步减轻褐化是可行的。综合尾叶桉愈伤组织诱导率、褐化率、抗氧化酶活性的统计分析结果及具体生长情况，0.10 μmol/L DPI处理对尾叶桉愈伤组织诱导、抗褐化效果最好。本研究为提高木本植物的愈伤组织诱导效率提供了新的思路。

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