裂叶马兰无性系建立的研究

摘 要： 为保护野生资源、满足栽培对种苗的需求，以裂叶马兰的嫩茎为外植体，进行愈伤组织诱导与分化、不定芽生根、试管苗生根继代增殖的研究，以及试管苗移栽和定植的研究，建立起裂叶马兰的无性系。结果表明：MS+ 蔗糖35 g·L-1 +6-BA0.5 mg·L-1+2，4-D2.5 mg·L-1是嫩茎愈伤组织诱导培养和继代增殖培养的适宜培养基；MS+蔗糖30 g·L-1+ AgN031.0 mg·L-1+GA31.0 mg·L-1 +ZT1.6 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1是愈伤组织分化培养的适宜培养基；1/2MS+蔗糖20 g·L-1 + NAA 0.6 mg·L-1是不定芽生根培养和试管苗生根继代增殖培养的适宜培养基；试管苗移栽成活率为95.9%；定植成活率98.0%。定植成活的试管苗保持了野生裂叶马兰的所有植物学性状。

关键词：裂叶马兰；嫩茎；无性系

中图分类号：S334.1 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.10.003

裂叶马兰（Kalimeris indica（L.）Sch.-Bip.）为菊科马兰属多年生草本植物[1-2]。生长于河岸、林内草地及山坡草地[3]。全草药用，具有凉血清热、利湿解毒等功效，能治出血、疟疾、黄疸、水肿淋浊、咳嗽、咽疼喉痹、乳痈痔疮、丹毒和蛇咬伤等疾病[4]。近十多年来，辽宁南部地区的养殖专业户，将裂叶马兰的干粉作为畜禽的饲料添加剂，能较明显地减少疾病发生，提高效益。正是由于裂叶马兰能防治多种人畜疾病，进入21世纪以来，辽宁南部地区的人们一直在大量的采收裂叶马兰作为中草药和家畜饲料添加剂，致使裂叶马兰的野生资源迅速减少。为保护野生资源，进行栽培，研究者对裂叶马兰进行了无性系建立的研究。此前已有马兰属植物组织培养研究的报道[5-6]，并且还有裂叶马兰芽分化培养研究的报告[7-8]，但迄今未见裂叶马兰愈伤组织无性系建立研究的报道。本研究的目的在于采用组织培养技术探索出裂叶马兰愈伤组织无性系建立的有效途径，从而为其保护和利用奠定技术基础。

1 材料和方法

1.1 材 料

6月上旬，把大连郊区柳树村山坡上生长旺盛裂叶马兰的地上部采回实验室，并冲洗干净。将叶柄、叶片剪掉，将嫩茎切成多个5 cm左右茎段后，放到磨口广口瓶中，用自来水洗涤振荡，再用0.05%安利洗涤液洗涤约10 min，用蒸馏水将材料上的安利洗涤液泡沫冲洗干净。在经过杀菌消毒处理的超净工作台上将材料用70%～75%乙醇灭菌10 s左右，立即用无菌水振荡洗涤3次，然后加入0.05%HgCl2溶液，浸泡灭菌14 min，并迅速用无菌水洗涤6次[9]，即可获得裂叶马兰的无菌材料。将无菌材料转移到底部覆有2层滤纸并经过无菌处理的培养皿中，准备剪切嫩茎接种[10]。固体培养基中琼脂含量为5.0 g·L-1，pH值5.8～6.0，每日持续光照12 h，光照强度为2 500 lx，恒温25 ℃培养。

1.2 方 法

1.2.1 不同浓度细胞分裂素与NAA、2，4-D对嫩茎段愈伤组织诱导培养的影响 以MS+ 蔗糖35 g·L-1为基本培养基，在添加不同浓度细胞分裂素与NAA、2，4-D的培养基上接种培养长0.3 cm左右的无生长点嫩茎段，进行愈伤组织的诱导培养。愈伤组织诱导培养在恒温光照的培养箱中进行。重复3次，每种处理培养50个材料。

1.2.2 不同浓度6-BA、ZT和KT与不同浓度的NAA、IBA对愈伤组织分化培养的影响 将在MS+ 蔗糖35 g·L-1 +6-BA0.5 mg·L-1+2，4-D2.5 mg·L-1培养基上继代增殖培养58 d的愈伤组织，用枪状镊子在培养瓶内将其分散为0.3 cm左右的颗粒状后，接种在以MS+蔗糖30 g·L-1+ AgN031.0 mg·L-1+GA31.0 mg·L-1为基本培养基，再添加不同浓度6-BA、ZT和KT与不同浓度的NAA、IBA的培养基上，进行愈伤组织分化培养试验。愈伤组织分化培养试验重复2次，每种处理培养50个材料。其培养条件与愈伤组织诱导培养的条件相同。

1.2.3 不同培养基对裂叶马兰不定芽生根培养的影响 配制8种不定芽生根培养基，即1/2MS+蔗糖20 g·L-1+IAA 0.3 mg·L-1、1/2MS+蔗糖20 g·L-1 + IBA 0.3 mg·L-1、1/2MS+蔗糖20 g·L-1 + NAA 0.3 mg·L-1、1/2MS+蔗糖20 g·L-1 +2，4- D 0.3 mg·L-1、1/2MS+蔗糖20 g·L-1+IAA 0.6 mg·L-1、1/2MS+蔗糖20 g·L-1 + IBA 0.6 mg·L-1、1/2MS+蔗糖20 g·L-1 + NAA 0.6 mg·L-1、1/2MS+蔗糖20 g·L-1 +2，4-D 0.6mg·L-1，将培养基进行灭菌后，把继代分化增殖培养的不定芽从基部剪下，接种到以上8种生根培养基上进行不定芽的生根培养试验。接种时不定芽形态学下部应插入培养基约0.7 cm，置于恒温光照的培养箱中进行生根培养。重复2次，每种培养基接种培养100个材料。

1.2.4 试管苗生根继代增殖培养 把在1/2MS+蔗糖20 g·L-1 + NAA 0.6 mg·L-1这种培养基上生根培养33 d的试管苗，用手术剪子在瓶内剪成至少具有2个叶片（实际上也至少具有2个生长点）、长1.5 cm左右的茎段后，继续接种到1/2

MS+蔗糖20 g·L-1 + NAA 0.6 mg·L-1这种培养基上进行试管苗的生根继代增殖培养。这一试验只进行了1次，连续继代增殖培养了5代。第一代接种培养了90个材料，之后每一代接种增殖培养的材料数目扩大1倍。

1.2.5 试管苗的移栽与定植 将第5代生根继代增殖培养的试管苗培养瓶瓶塞除掉，置于日光温室中炼苗3 d。之后，将700株试管苗移栽到上半层为河沙、下半层为园土的温室营养钵中。

把在温室营养钵中移栽成活的试管苗，于5月中旬定植到水库旁的山坡草地上，共定植400株。

2 结果与分析

2.1 不同浓度细胞分裂素与NAA、2，4-D对嫩茎段愈伤组织诱导培养的影响

培养到66 d时进行诱导影响统计观察，结果由表1可见，在不同浓度细胞分裂素与不同浓度的NAA、2，4-D的培养基上，均可不同程度地诱导培养出愈伤组织，但其效果差异较大。从诱导2.2 不同浓度6-BA、ZT和KT与不同浓度的NAA、IBA对愈伤组织分化培养的影响

培养到60 d时进行统计观察，结果如表2所示。在愈伤组织的分化培养试验中，在加入细胞分裂素KT的培养基上，愈伤组织不分化；在加入生长素IBA的培养基上，愈伤组织也不分化；其效果较理想的是不同浓度ZT与NAA的培养基上，其中最好的是在ZT0.8 mg·L-1与NAA0.1 mg·L-1配合使用的培养基上，不仅培养的愈伤组织分化率最高，达到了96%，并且每块培养的愈伤组织接种后每11 d观察统计记录一次生根情况，生根培养33 d时观察统计结果证明：1/2MS+蔗糖20 g·L-1 + NAA 0.6 mg·L-1是裂叶马兰不定芽生根培养的理想培养基。在这种培养基上，经过33 d的培养，就会培养出1代生根率99%、试管苗平均高度5.2 cm、具有8.3个叶片、茎粗0.21 cm、外观上生长旺盛的试管苗。观察还表明，在这种培养基上培养至第5 d时可见有的培养材料开始生根。之后，生根率、根长、根数都不断增加。初期生长的根为白色，后期为绿色。

2.4 试管苗生根继代增殖培养

连续5代生根继代增殖培养的统计观察结果证明：每一代的繁殖周期为31 d、繁殖系数为3.2、生根率为99.2%，并且外观上试管苗根系均为绿色、生长非常旺盛。按照31 d的繁殖系数为3.2的繁殖速度计算，1株试管苗1年至少能保证繁殖出50万株试管苗。这种繁殖速度完全能满足保护野生资源和栽培对裂叶马兰种苗的需求。这也说明：1/2MS+蔗糖20 g·L-1 + NAA 0.6 mg·L-1也是裂叶马兰试管苗生根继代增殖培养的适宜培养基。

2.5 试管苗的移栽与定植

移栽后36 d统计证明：移栽成活671株，成活率为95.9%。

定植后42 d统计显示：定植成活392株，成活率98.0%。定植成活的试管苗当年9月开花、10月结果，保持了野生裂叶马兰的所有植物学性状。

3 讨 论

在本研究中无生长点嫩茎段诱导培养的愈伤组织和继代增殖培养的愈伤组织，是在相同的条件下进行的。但是，后者经过58 d为一个培养周期培养的愈伤组织与前者经过65 d为一个培养周期培养的愈伤组织相同，后者的培养周期缩短7 d。之所以会产生着这种现象是由于以下原因引起的：一是前者使用的材料是无菌茎段，在剪切和灭菌中受到了损伤，接种到培养基上需要一段恢复时间；二是前者原来是在野外的土壤上生长的，将其转移到培养基上进行人工培养需要有一个适应性过程，而后者是在相同的条件下和相同的培养基上生长的，不需要这个适应过程。

在本研究中的不定芽生根培养的试管苗和生根继代增殖培养的试管苗，均可生长出绿色的根系。在培养基中形成绿色的根系说明，试管苗根系也能进行光合作用，对培养环境具有很强的适应性。在前人的研究中，有时会出现试管苗根系发黑的现象[11-12]，这往往是由于培养基中缺氧，根系产生无氧呼吸造成的。而试管苗形成的绿色根系，在进行光合作用时必然产生氧气，有利于试管苗根系代谢活动获得所需要的氧气，从而促进试管苗的旺盛生长。

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