石墨化碳纤维―离子液体复合物构建过氧化氢酶传感器研究

【摘 要】选取两种结构相似的离子液体（1-羧甲基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-羧丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐），分别与石墨化碳纤维混合研磨制备复合材料，扫描电镜显示所制得的复合物均呈凝胶形态。复合材料修饰电极后，分别对过氧化氢酶（Cat）分子进行自组装结合，羧甲基离子液体-石墨化碳纤维复合物能够较好地促进Cat的直接电子传递，在-0.46 V （vs. SCE）处表现一对可逆的氧化还原峰，且对酶底物过氧化氢呈现灵敏的电催化传感响应。

【关键词】石墨化碳纤维；离子液体；过氧化氢酶；生物传感器

石墨化碳纤维或离子液体修饰电极都可以有效提高电极性能[1-2]。在过氧化氢酶研究领域，Pamula E 和Rouxhet PG细致研究了碳纤维吸附过氧化氢酶（Cat）的行为及影响因素，发现碳纤维的表面功能对过氧化氢酶的吸附具有一定的影响，含有生物相容性基团的碳纤维对过氧化氢酶表现较好的吸附性能[3]。Saadati， S（Saadati， Shagayegh）等将过氧化氢酶与氨基化离子液体层层组装到钛基纳米管表面，探究了过氧化氢酶的直接电子传递行为，以及构建在电子传递基础之上的过氧化氢传感器，充分体现了其灵敏性与生物相容性[4]。Chen等进一步研究了离子液体和DNA的复合物对几种氧化还原蛋白质的电子传递促进行为，研究发现离子液体对蛋白质分子具备很好的生物相容性，实现了蛋白质和电极之间的直径电子传递行为，为构建相应的生物传感器奠定了很好的前期基础[5]。电化学还原制备的氧化石墨烯修饰电极后，可以进一步促进过氧化氢酶的吸附和电子传递，结合的过氧化氢酶对过氧化氢具备非常灵敏的催化性能，线性范围为0.05 到 1.91 uM，灵敏度达7.76 uA mM-1 cm-2[6]。

至今，石墨化碳纤维-离子液体复合物修饰电极构建过氧化氢酶的研究还未见报道，开展该领域的实验具有一定的探索意义和研究价值。本项目将首先制备石墨化碳纤维-离子液体的复合材料，并将其用于过氧化氢酶的电子传递研究领域，探讨酶结构和性能、组建新型传感器。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

CHI-660B型电化学工作站（上海辰华仪器公司）；S-4800型扫描电子显微镜（日本日立公司）。石墨化碳纤维GNFS（中国科学院成都有机化学有限公司），使用之前经浓硫酸-浓硝酸混合液（体积比3：1）进一步纯化；1-羧丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-羧甲基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（IL），中国科学院兰州化物所）；过氧化氢酶Cat（美国Sigma公司），用时当天配制；实验室用水为超纯水。

1.2 复合材料的制备及修饰电极构建

取15μL 1-羧丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐和5 mg GNFS于玛瑙研体A中，取15μL 1-羧甲基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐和5 mg GNFS于玛瑙研体B中，各研磨1小时，放置30min后，分别将它们转移至离心管，超声清洗、离心，去除未结合的离子液体，得到石墨化碳纤维1-羧甲基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐复合物（记做GNFS-IL（A））和石墨化碳纤维1-羧丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐复合物（记做GNFS-IL（B）），分别分散到5ml水中备用。取6mgCat溶解于1ml中，制得6 mg/ml（前后形式一致）的Cat溶液。

取上述各分散液20 μL滴到磨平、洗净、晒干的玻碳电极表面，自然挥发后，形成薄且均匀的修饰层，即制得复合物修饰（玻碳）电极（GNFS-IL（A）/GCE， GNFS-IL（B）/GCE）。之后，各修饰电极浸入6 mg/ml的Cat溶液中，过夜，取出水洗，待用。

1.3 实验方法

电化学检测采用三电极体系：复合物修饰（玻碳）电极为工作电极，饱和甘汞电极（SCE）为参比电极，铂电极为对电极。以0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS）为底液，通入纯氮气除去溶解氧、并保持氮气氛围。实验均在室温下进行。

2 结果与讨论

2.1 复合物的扫描电镜特征

纤维是指长度比直径大千倍以上且具有一定柔韧性和强力的纤细物质。图1分别是GNFS-IL（A）和GNFS-IL（B）复合物的扫描电镜（SEM）图。从图中可以看出：两种复合物中已基本观察不到GNFS的纤维结构，并且在一定程度上表现出黏连的现象，在GNFS-IL（A）图中表现得比较清晰，有大片粘在一起的形态，整体呈片状，且片状面积较大。而相较于GNFS-IL（A），GNFS-IL（B）局部图则比较整齐规则，出现了小范围的黏连，片状面积较小，除了小碎片状的形态，还有一些条状的形态。以上特征的出现主要是由于GNFS和IL之间的结合，IL的凝胶膜引发了GNFS表面形态上的变化。

GNFS-IL（A）复合物的SEM图

图1 复合物的扫描电镜图

2.2 循环伏安法（CV）

图2为复合物修饰（玻碳）电极，GNFS-IL（A）/GCE， GNFS-IL（B）/GCE）浸入6 mg/ml的Cat溶液中，过夜，取出水洗，置于0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS）中，经过几次循环伏安扫描后得到的伏安循环图。两电极在相同条件下进行循环伏安扫描，都出现了氧化还原信号。其中a图是GNFS-IL（A）复合物的扫描图像，在-0.46V（vs.SCE）左右可观察到一对Ep= Epa- Epc= 0. 489 V- 0. 439 V = 0. 05 V，即50 mV左右的还原氧化峰。而b图是复合物GNFS-IL（B）的扫描图像，在-0.47 V（vs.SCE）左右可观察到一对Ep= Ep a- E pc= 0. 488 V- 0. 443 V = 0. 045 V，即45 mV左右的还原氧化峰。从图中不难发现，石墨化碳纤维―1-羧甲基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐复合物表现出了更好的电化学响应，氧化还原电对的特征峰更加明显。经过多次重复试验，结果也印证了这一点：Cat在GNFS-IL（A）复合物修饰的电极上可以更好的实现其与电极的直接电子传递。所以在研究后续相关的问题时我们将会更多的关注GNFS-IL（A）复合物。

图2 伏安循环图

GNFS-IL（A）制得的伏安循环曲线中可以看出，其阴极峰电势Epc为-0.489 V，阳极峰电势Epa为-0.439 V，电势差为50 mV，式电势E0以（Epc+Epa）/2=-0.464 V，这是Cat血红素辅基中氧化还原中心Fe（III）/Fe（II）的氧化还原特征峰。在此范围内，用高温处理的Cat进行实验，并没有出现氧化还原峰，也印证了上面的观点。

随着扫描速度的增加，峰电流不断增大，而且还原峰电位负移，氧化峰电位正移。而Ep都在50 mV以内，表明在GNFS-IL（A）/GCE中Cat的电子传递可逆程度较高，一方面是因为IL凝胶膜为Cat提供了微水环境，有利于保持其分子活性[7-8]；另一方面，GNFS-IL具备良好的生物相容性和导电性，可与Cat进行快速的电子传递。根据准可逆薄层电化学过程的Laviron方程[9]可求出电活性物质发生电极反应时的电子转移数为0.927（≈ 1），说明GNFS-IL（A）/GCE中的Cat发生了单电子转移准可逆的氧化还原过程。

2.3 pH值对循环伏安行为的影响

图3 溶液pH值对循环伏安图的影响

其中（a）pH=2.99；（b）pH=5.01；（c）pH=7.00.

图3为不同pH条件下的Cat响应，用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠制备了pH分别为3，4，5，6，7，8，9，10，11的缓冲溶液，分别针对复合物GNFS-IL（A）制得伏安循环图，但为了更好地在一张图中呈现出来，这里只选出pH为2.99，5.01，7.00的缓冲溶液下的Cat响应。可以观察到，随着底液pH值的增大，复合物修饰（玻碳）电极的循环伏安阴阳两极峰电位均发生明显负移，而峰形，峰电流没有明显变化。将CV阴极峰电位和阳极峰电位的平均值E0，作为Cat电对式量电位的近似值，来考察pH值对式量电位的影响[10]（如图4）。结果表明，E0，与pH值之间存在良好的线性关系，其斜率为-49.3 mV/pH。由图可得，在pH

3.0到8.0之间时，其斜率的绝对值其实大于49.3 mV/pH，这样实验值就更接近18。C时可逆体系的理论值-57.7 mV/pH说明复合物修饰的（玻碳）电极中的Cat发生一个电子转移的同时还有可能伴随一个质子的转移。但当pH值大于8时，斜率的绝对值就变小了，说明E0，随pH值变化的趋势变缓。

图4 溶液pH值对E0，的影响

3 结论

凭借IL优良的溶解性，通过研磨它和GNFS的混合物，制备了新型的二元复合物。然后在GNFS-IL/GCE上修饰的Cat表现出了良好的电化学响应， 显示Cat发生了单电子转移准可逆的氧化还原过程。体系的pH对循环伏安峰的位置有明显的影响，且复合物修饰的（玻碳）电极中的Cat发生一个电子转移的同时还有可能伴随一个质子的转移。结果表明GNFS-IL/GCE在构建过氧化氢酶传感器研究领域具备潜在的应用前景。

【参考文献】

[1]Hasanzadeh， M ， Shadjou， N ， Eskandani， M ， de la Guardia， M ， Room-temperature ionic liquid-based electrochemical nanobiosensors[J].Trac-trends in Analytical Chemistry，2012， 41： 58-74.

[2]Huang， JS， Liu， Y， You， TY， Carbon nanofiber based electrochemical biosensors： A review[J]. Analytical Methods. 2010，2（3）：202-211.

[3]Pamula， E， Rouxhet， PG， Influence of surface properties of carbon fibers on the adsorption of catalase[J].Carbon， 43（7）： 1432-1438.

[4]Saadati， S ， Salimi， A ， Hallaj， R， Rostami， A ， Analytical Chemical ACTA[J]. 2012， 753： 32-41.

[5]Chen， T， Xiong， HY，Wen， W， Zhang， XH，Wang， SF， Bioelectrochemistry[J]. 2013， 91：8-14.

[6]Ting， SW，Periasamy， AP，Chen， SM.Saraswathi， R， International Journal of Electrochemical Science[J]. 2011， 6（10）：4438-4453.

[7]Compton D L， Laszlo J A. Journal of Electroanalytical Chemistry [J]. 2002， 520： 71.

[8]Ding S F， Wei， W， Zhao G C. Electrochemistry Communications [J].2007， 9（9）： 2202.

[9]Laviron E. Journal of Electroanalytical Chemistry[J].1979， 101： 19.

[10]LI Min， CHEN Zhi-min， XIN Xian-rong. Direct Electrochemistry of Catalase Incorporated in Col lagen Films[J].Journal of Shanxi University， 2006，29（2）：179-181.

基金项目：嘉兴学院大学生研究训练计划项目（SRT，851713007）。

作者简介：楼炬峰（1994―），男，汉族，浙江萧山人，嘉兴学院应用化学专业学生。