九种植物提取物对小麦白粉病菌孢子萌发的影响

摘要：以水和50%乙醇做为溶剂，提取9种植物的活性物质，通过小麦白粉病菌孢子萌发试验进行抑菌活性测定。结果表明，9种植物50%乙醇提取液都能抑制小麦白粉病菌孢子萌发，仅有山苍子和辣椒的水提取液对小麦白粉病菌孢子萌发有抑制作用。因此，可尝试以上述植物为原料研制植物源农药来防治小麦白粉病。9种植物提取物对白粉病菌孢子萌发的影响与提取物成分、浓度相关，将大蒜、女贞子（烘干）、辣椒和烟皮的乙醇提取液稀释11.00倍，辣椒水提液稀释2.25倍仍然表现出较强的抑菌活性。不同提取液中抑制小麦白粉病菌孢子萌发的活性物质的种类还需进一步研究。

关键词：植物提取物；抑菌活性；小麦白粉病菌；孢子萌发

中图分类号：S435 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）09-2127-05

小麦白粉病是在全球范围内广泛发生、危害程度严重的三大病害之一，近年来在中国近半数的麦田中发生与流行，尤其是在黄淮平原，频繁多发[1，2]。小麦叶片受侵染后，呼吸强度增加，光合效率降低[3]，导致干物质积累减少，轻病田减产5%～10%，重病田减产20%以上[4，5]。生产上选用抗病品种和使用杀菌剂是防治白粉病的两个主要措施[6]。但中国小麦品种遗传基础较为狭窄，抗病品种育种进程缓慢；已有抗性品种由于长期使用导致其抗病性逐渐丧失，以至于近年来白粉病的危害日益严重[7，8]。三唑类药剂是防治小麦白粉病的重要药剂，但由于长期使用，一方面导致病原菌的抗药性逐年增强[6]；另一方面，随着农药残留、食品安全与环境生态安全等问题越来越受到重视，三唑类药剂防治存在弊端日益突出，因此在生产实践中急需安全有效的白粉病防控技术。

植物是生物活性化合物的天然宝库，其中的大多数化学物质，如萜烯类、生物碱、类黄酮、甾体、酚类、独特的氨基酸和多糖等均具有杀虫或抗菌活性。近年来对植物提取物的抑菌、杀菌活性进行了广泛而深入的研究。张应烙等[9]对井冈山47种植物提取物的研究发现，山鸡椒、凹叶厚朴和深山含笑提取物中含有抗菌成分，且抑菌谱较广，值得进一步研究。喻大昭等[10]以黄瓜灰霉病菌为供试菌，对49种植物粗提物进行了生物活性筛选，结果表明，油茶和辣蓼粗提物的抑菌活性较高。陈娇等[11]通过58种植物提取液对葡萄霜霉病菌的游动孢子囊萌发抑制率和接种叶圆盘的发病控制进行研究，筛选出虎耳草、黄檀、马尾松、牡丹、刺槐5种具有抑菌作用的植物提取液。孙海峰等[12]以龙胆斑枯病菌为供试菌，对9种中药乙醇提取物进行抗菌活性试验，结果发现9种中药乙醇提取物均有抑菌作用，其中蛇床子、川楝子、知母具有较强的抗龙胆斑枯病菌作用。目前报道有1 389种植物有可能作为杀菌剂，植物中的抗毒素、类黄酮、罹病相关蛋白质、有机酸和酚类化合物等均具有杀菌或抗菌活性[13]。上述研究结果为今后从事植物源杀菌剂的进一步研究提供了很好的支持。本研究以小麦白粉病菌为供试菌，研究9种植物提取物对该菌孢子萌发的抑制作用。一方面，比较不同植物提取物抑菌效果差异，为进一步深入研究其抗菌成分奠定基础；另一方面，为研制抗小麦白粉病的新型植物源农药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试植物：山苍子购自安徽亳州中药材批发市场；辣椒、大蒜购自西昌市农贸市场；女贞子、小叶女贞子、小叶黄杨果实采自西昌学院校园；烤烟叶片和茎秆表皮采自西昌学院教学实习农场。白粉病菌孢子采自西昌学院教学实习农场温室。

1.2 试验方法

1.2.1 植物样品提取 供试植物材料在恒温鼓风干燥箱中高温（55 ℃）烘干至恒重，用烟叶专用粉碎机粉碎，山苍子过孔径为1 mm的钢筛，其余材料过50目钢筛，粉碎物料装入棕色广口瓶中避光、干燥保存备用。分别采用去离子水和50%乙醇两种溶剂提取植物样品成分。准确称取1.50 g试样于三角烧瓶中，加入50 mL溶剂混匀。以去离子水做提取溶剂的处理：将其置100 ℃水浴锅中，浸提3 h，冷却至室温，4 000 r/min离心10 min，收集上清液，用去离子水定容至50 mL。50%乙醇做提取溶剂的处理：将其置30℃恒温振荡培养箱中，浸提15 h，4 000 r/min离心10 min，收集上清液，用50%乙醇定容至50 mL。

1.2.2 提取液多糖含量测定 ①标准溶液的配制：精密称取干燥至恒重的葡萄糖标准品0.20 g，置100 mL容量瓶中，加去离子水溶解定容，制成2.000 mg/mL的标准溶液，依次量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 、0.9、1.0 mL标准溶液，置于10 mL容量瓶中，去离子水定容至刻度，配成系列标准溶液。②蒽酮-硫酸试液的配制：称取0.200 g蒽酮和1.000 g硫脲，加入100 mL浓硫酸，置于棕色瓶中，混合摇匀置暗处备用。③标准曲线的绘制：分别准确移取系列标准溶液1 mL于具塞试管中（各平行3份），以1 mL去离子水作为空白，各加入5 mL蒽酮试剂（立刻摇匀，置冰水浴中），置于沸水浴10 min， 迅速置冰水浴冷却10 min后，在波长为626 nm处测定吸光度4次。计算线性回归方程，绘制标准曲线。④样品溶液的测定：分别准确移取待测样品溶液1 mL于具塞试管中（各设平行3份），以1 mL去离子水作为空白，各加入5 mL蒽酮试剂（立刻摇匀，置冰水浴中）， 置于沸水浴10 min，迅速置冰水浴冷却10 min，以首管作为空白，在波长为626 nm处测定吸光度4次。

1.2.3 白粉病孢子萌发试验 ①水-琼脂培养基制备：称取4.00 g琼脂粉，加100 mL去离子水混匀，在高压灭菌锅中灭菌15 min，取出后倒在玻璃板上，铺成厚度约为1.0 mm的培养基。用无菌打孔器在培养基上打孔，取出琼脂片，在植物提取液中浸泡48 h备用，以提取溶剂作为空白对照。②孢子萌发：从小麦叶片上剪下梭形白粉病孢子堆，将孢子印在浸泡48 h的琼脂片上，然后放在载玻片上，放入垫有湿润滤纸的培养皿中，在15 ℃恒温培养箱中培养24 h，取出观察孢子萌发状态。依据萌发孢子的数量和芽管长度，将孢子萌发状态分为5级（表1，图1）。③最小抑菌浓度测定：分别将300、600、900、1 200、1 500、1 800、2 100、2 400 μL提取液原液加入到3 000 μL提取溶剂中，使提取液浓度分别稀释为原液浓度的11.00、6.00、4.33、3.50、3.00、2.67、2.43、2.25倍。用稀释后的提取液浸泡琼脂片48 h做为孢子萌发载体，观察孢子萌发状态。以孢子不萌发时的稀释浓度为最小抑菌浓度，分别以相应提取溶剂作空白对照。

1.3 数据统计

试验数据使用Excel 2003和SPSS 17.0进行回归分析、方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 植物提取物多糖含量测定

根据标准曲线（图2），葡萄糖含量在波长626 nm处与吸光度呈良好的线性关系，y=4.874 5x-0.056 5（R2=0.97）。9种植物提取物多糖含量测定结果见表2。测定结果表明，以去离子水做为提取溶剂，在100 ℃水浴中浸提3 h，不同植物材料提取液的多糖含量差异极显著（F=2 391.862，P=0.000）；其中大蒜提取液中多糖含量最高，达到15.56 mg/mL，其次为小叶女贞子和烟叶，山苍子提取液含量最低，仅0.64 mg/mL。以50%乙醇为提取溶剂，在30 ℃振荡提取15 h，不同植物材料提取液的多糖含量差异也达到极显著水平（F=336.602，P=0.000）；其中仍然是大蒜提取液中多糖含量最高，达到14.73 mg/mL，其次为小叶女贞子、小叶黄杨和烟叶，山苍子提取液含量最低，仅0.61 mg/mL。

同一种植物材料用不同溶剂处理，其多糖含量也有极显著或显著差异。其中烟皮水提取液的多糖含量极显著高于50%乙醇提取液，相差达4.96 mg/mL（t=68.619，P=0.00）；女贞子（晒干）、辣椒、大蒜水提取液的多糖含量也极显著高于50%乙醇提取液（t值分别为4.457、14.254和3.001）；小叶黄杨、烟叶和小叶女贞子水提取液的多糖含量极显著低于50%乙醇提取液（t值依次为15.922、1.217和3.681）；女贞子（烘干）、山苍子和烟叶的水提取液的多糖含量与50%乙醇提取液的含量差异不显著。

2.2 不同提取液对小麦白粉病孢子萌发的影响

分别用在水提取液和50%乙醇提取液中浸泡48 h的琼脂片做为孢子萌发载体，在15 ℃恒温培养箱中培养24 h和48 h后镜检，以5级分类法评价孢子萌发状态（表3）。结果表明，不同提取液对小麦白粉病孢子萌发程度有不同的影响。在辣椒和山苍子的水提取液浸泡的琼脂片上，48 h仍然未观察到开始萌发的孢子，表明两种提取液能抑制白粉病孢子萌发；其余几种提取物在24 h内延迟孢子萌发，48 h时孢子萌发程度与空白对照接近。9种植物的50%乙醇提取液，均能有效抑制白粉病孢子萌发，除烟叶提取液中有少数孢子开始萌发外，其余几种提取液在48 h仍然未发现萌发的孢子。表明不同溶剂对提取液的成分有重要影响，9种植物的提取液中50%乙醇具有抑菌活性的成分比水提取液要多。

2.3 提取液的最低抑菌浓度

不同的植物的水提取液对小麦白粉病孢子萌发的抑制活性不同，从提取液的最低抑菌浓度来看，辣椒水提液抑菌活性最强，最低抑菌浓度为稀释2.25倍；然后是山苍子水提液，其最低抑菌浓也为稀释2.25倍，但其稀释6.00倍时孢子萌发程度即与对照相同，且高于辣椒水提液（表4）。其余几种植物水提液在稀释后，孢子萌发程度基本与对照无明显差异。

50%乙醇提取液在梯度稀释后，抑菌活性也有较明显变化。大蒜、女贞子（烘干）、辣椒和烟皮的最低抑菌浓度都是稀释11.00倍，表现出较强的抑菌活性；其次是小叶黄杨和女贞子（晒干），最低抑菌浓度是稀释3.00倍；然后是小叶女贞子，其最低抑菌浓度是稀释2.67倍；烟叶在稀释2.25倍时有少数孢子萌发，但孢子萌发程度与对照差异较大，绝大多数孢子都未萌发（表4）。

3 小结与讨论

一方面，植物的抑菌活性物质成分复杂、多样，不同植物中所含的主要抑菌活性物质也有所不同，如苦参中含有苦参碱[13，14]，蛇床子中含有蛇床子素、香豆素[15]，黄柏中含有小檗碱[16]，木姜子挥发性油中含的萜类物质等[17]。另一方面，具有抑菌活性的植物提取物中，既有主要成分，也有辅助成分，如多糖等。多糖是植物中普遍存在的一类物质，也是植物抑菌活性物质之一。研究表明，不同浓度的大叶木姜子叶多糖水溶液对金黄色葡萄球菌、酵母菌、灰绿曲霉和黑曲霉均有一定的抑制作用，并且都有随着浓度的增加，抑菌效果增强的趋势[18]。海带多糖对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌均有一定的抑制作用[19]；鱼腥草多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用[20]。本研究表明，中山苍子和辣椒的水提取液和50%乙醇提取液都能抑制小麦白粉病孢子萌发，但其抑菌活性明显与多糖含量高低无关，其提取物中的其他物质是其主要的抑菌活性成分。而小叶黄杨、烟叶和小叶女贞子仅50%乙醇提取液能抑制小麦白粉病孢子萌发，且这3种植物的醇提取液的多糖含量均极显著高于水提取液，说明其多糖可能是主要的抑菌活性物质之一。

分生孢子的萌发是白粉病田间流行和再侵染的关键环节，因此，抑制分生孢子萌发就可以有效控制病害流行，减轻其危害程度。刘彩云等[21]研究表明，不同形态硅源制剂对白粉菌孢子萌发有较大影响，进而对白粉病产生一定的防治效果。本研究中3种水提取液和9种50%乙醇提取液均对小麦白粉病孢子萌发有不同程度的抑制作用，有关这些植物提取物对小麦白粉病的抑制效果或防治效果尚有待于进一步的田间试验研究。

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