褪黑素对鼠心肌缺血再灌注后血流动力学的影响

作者：袁媛，龙村，关彬，史世勇，温福兴，张燕婉

【关键词】 褪黑素

摘要：目的 探讨不同浓度褪黑素预处理对成年大鼠心肌缺血-再灌注（I/R）后血流动力学的影响。方法 32只成年S-D大鼠（350~400g）随机分为4组，每组8只，利用Langendorff模型灌注其离体心脏，待心脏功能稳定后，对照组平衡30min后缺血再灌注，预处理组则用不同浓度的褪黑素灌注30min后缺血再灌注。各组均为常温（37℃）缺血25min，复灌60min。观察各组血流动力学改变。结果褪黑素预处理组左心功能恢复明显高于对照组。结论 褪黑素预处理促进成年大鼠心肌缺血-再灌注（I/R）后血流动力学恢复。

关键词：褪黑素；预处理；缺血?再灌注损伤；心肌保护

Effects of Melatonin on Isolated Rat Myocardial Blood Stream Dynamics after Ischemic-Reperfusion

Abstract: OBJECTIVE To investigate the protective effects of Melatonin on post-ischemic blood stream dynamics in isolated Sprague-Dawley rat myocardium.METHODS 32Sprague-Dawley rats (350~400g) were randomly divided into 4 groups. Hearts were subjected to 25 min of normothermic global ischemia followed by 60 min of reperfusion.RESULTS Duration of ventricular arrhythmia significantly decreased and LVDP, ±dp/dtmax recovery had a significant improvement in melatonin pretreatment groups. CONCLUSION Melatonin is an effective agent for protection against post-ischemic reperfusion injury.

Key words：Melatonin; Preconditioning; Ischemic-reperfusion; Cardioprotection

心肌缺血-再灌注（Ischemia/Reperfusion, I/R）损伤的保护是心血管外科手术中的重要内容之一。I/R期间，产生大量自由基，内生性自由基清除物，如过氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶及谷胱甘肽超氧化物酶等不敷所需而产生细胞损害。引起I/R损伤的另一个重要因素是心肌梗死区域多形核白细胞（PMNs）的激活和渗透。近年来，许多研究证实，褪黑素（Melatonin, MLT）作为一种自由基清除剂对心肌缺血-再灌注损伤有明显的保护作用。本实验旨在探讨不同浓度褪黑素预处理对成年大鼠心肌缺血-再灌注损伤后血流动力学的影响，并希望从机制上对此加以讨论。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与试剂

多导生理记录仪（Macintosh，Quadra610，Japan），超级恒温器（WC/09-05，重庆实验设备厂），恒温循环器（HX-10555，北京四环科学仪器厂），改良Langendorff装置，Stockert-shillyⅡ型灌注泵（Germany），混合气（O2:CO2=95%:5%，北京普莱克斯公司），超纯水（SZ-93自动双重纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂）。褪黑素(MLT)为美国Sigma公司产品。St. Thomas Ⅱ停搏液由阜外心血管病医院普惠公司提供。Krebs-Henseleit重碳酸盐缓冲液试剂由阜外心血管病医院麻醉体外循环研究室配制。

1.2 动物模型的建立

实验大鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。鼠重350~400g。以戊巴比妥钠腹腔麻醉（50mg/kg），经股静脉肝素化（150IU/kg），正中开胸迅速取出心脏，浸入4℃Krebs-Henseleit缓冲液中，主动脉略加修剪，立即连于Langendorff灌注装置开始灌注，初始灌注用通以混合气（O2:CO2=95%:5%）的Krebs-Henseleit缓冲液，温度37℃，主动脉灌注压为70mmHg，剪开肺动脉根部以保证冠脉回流液通畅引流，剪开左心耳，插入左房灌注管，立即将心脏移入保温缸（38±1℃）内。凡心率小于250次/min，左室收缩压峰值小于80mmHg，或冠脉流出液小于8ml/min的心脏弃之不用。

1.3 实验分组及步骤

将32只成年S-D大鼠（350~400g）随机分为4组(每组n=8), Ⅰ组（对照组）：离体心脏经Krebs-Henseleit缓冲液灌流平衡30min后，St. Thomas Ⅱ停搏液常温（37℃）停跳；Ⅱ组：Krebs-Henseleit缓冲液中加入10μM/L MLT，其余步骤同Ⅰ组；Ⅲ组：Krebs-Henseleit缓冲液中加入30μM/L MLT，其余步骤同Ⅰ组；Ⅳ组：Krebs-Henseleit缓冲液中加入100μM/L MLT，其余步骤同Ⅰ组。4组均经历常温（37℃）停跳25min，再灌注60 min。

1.4 测定指标

平衡20min后，记录冠脉流出量（CF）、HR、LVDP、±dp/dtmax等血流动力学指标作为基础值。分别将再灌注后5、10、15、30、60min的上述指标表达为其对基础值的恢复率。整个过程连续监测心电图(ECG)， 观察室性心律失常的发生率和持续时间。

1.5 数据表达和统计学分析

应用SPSS 11.5 软件包进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（ ±s）表示，缺血再灌注室颤发生率的比较用X2检验，P＜0.05为差异具有显著性。

2 结果

2.1 缺血前4组的CF、HR、LVDP、±dp/dt-max等血流动力学指标无显著性差异(表1)。表1 缺血前各组血流动力学指标 （略） 注：各组间两两比较，P值均＞0.05

2.2 褪黑素对心肌缺血再灌注心律失常的影响(表2) 各褪黑素预处理组均能显著降低心肌缺血再灌注诱发的室性心律失常的发生率,缩短持续时间,有明显的负性变频作用,其中Ⅳ组（100μM/L MLT组）的作用最强。表2 褪黑素对心肌缺血再灌注心律失常的影响（略） 注：与对照组相比, #P<0.01 ，*P<0.05

2.3 缺血-再灌注（I/R）后血流动力学变化（表3） 再灌注后, 褪黑素预处理组LVDP,±dp/dtmax在多个时点上的恢复率均较对照组显著性增高，尤其是Ⅳ组，Ⅱ组和Ⅲ组之间差异不显著。表3 再灌注后血流动力学恢复情况（%）注：〖HT6SS〗同一时间点与对照组比较，#P<0.01， * P<0.05

3 讨论

褪黑素（N-乙酰-5-甲氧基色胺）是松果体细胞合成的一种吲哚胺，存在于所有脊椎动物（包括人）体内，调节生物节律，夜间合成及分泌旺盛，一经合成立即释放入血。褪黑素兼具亲水性和疏水性,可自由通过任何器官组织细胞的形态生理屏障及各种体液［1,2］。

有研究表明，自由基由缺血再灌注的心肌细胞线粒体产生，引起脂质过氧化，氧化氨基酸及其肽链，导致I/R心脏左室功能不良及心律失常［3］。近年来，许多研究证实，褪黑素不仅可抑制这些自由基的产生，而且可直接消除已形成的自由基及其相关反应物的活性［4］，可明显改善缺血-再灌注后心肌血流动力学。

羟自由基（・OH）在I/R损伤中十分重要，比超氧阴离子自由基（O2・-）或过氧化氢（H2O2）有更强的化学反应性［5］，是公认的最活泼也是最具危害性的自由基，它可与产生部位的任何生物分子反应，由氧化应激所造成的损害几乎全部是由・OH中介的，而MLT正是其高效清除剂［6］。MLT与氧自由基相互作用的产物，如3-羟基褪黑素及N-乙酰基-5-甲氧基犬尿氨酸褪黑素，同样是有效的自由基清除剂［4,7］，这样的协同效应进一步增强了MLT对・OH的清除能力，提高了其保护效果。除氧自由基外，氮氧衍生物，尤其是ONOO-和过氧氮酸ONOOH也参与了心肌细胞I/R损伤，MLT可抑制这些具有毒性的物质［8］。线粒体、微体及核膜均含有可产生自由基的电子运输系统［9］。I/R时，线粒体呼吸率明显增加，产生大量自由基，超出细胞内生性自由基清除系统的清除能力。MLT作用于线粒体呼吸链，减少电子渗漏和自由基生成［10］，其减少电子渗漏的作用与其刺激复合物Ⅰ和Ⅳ的活性，刺激ATP生成［9］和减轻氧化物对线粒体DNA的损伤有关。MLT不仅可直接清除自由基，还可促进氧自由基降解为无毒性或毒性较低的物质。MLT促进过氧化物歧化酶（一种重要的抗氧化物酶，使O2・- 歧化为H2O2）的活性和基因表达［11］。MLT还可促进代谢H2O2的过氧化氢酶及谷光甘肽超氧化物酶（GPx），减少・OH的生成［12］。MLT的这些间接的抗氧化作用对其保护作用起放大效应。体内产生的自由基极易损害细胞脂质中的不饱和脂肪酸，形成脂质自由基，引起脂质过氧化反应。脂质过氧化反应对生物膜内类脂结构破坏极大，反应中产生的自由基可以不加区别地与细胞中其他物质如蛋白质和核酸作用，造成酶、染色体结构和功能的破坏。过氧化脂质的代谢产物丙二醛（MDA）又可通过蛋白质一级氨基集团反应与蛋白质交联，造成细胞功能的破坏。MLT可以稳定细胞膜及各种细胞器生物膜，保护线粒体、微体免受氧自由基的破坏［13］。有研究表明MLT可预防I/R引起的血管功能失调及细胞能量衰竭［14］，可对抗细胞外Ca2+内流，减轻Ca2+超载［15］。H2O2引起细胞内Ca2+储库释放Ca2+及Ca2+通过内流通道进入细胞内，MLT可明显抑制H2O2引起的Ca2+内流［16］。参与I/R损伤的另一个重要因素是心肌梗死区域多形核白细胞（PMNs）的激活和渗透［5］。细胞的激活促进黏附分子（选择素和ICAM）的表达，启动细胞间相互作用瀑布，促使中性粒细胞黏附在内皮细胞表面及其穿越内皮细胞移位 ，并直接与心肌细胞相互作用。MLT可减少P选择素和ICAM的表达［17］，有助于减轻I/R损伤。本实验研究提示，心肌缺血前用褪黑素预处理，可明显改善心脏血流动力学，为缺血后心脏功能的恢复创造了有利条件。

参考文献：

［1］Shida CS, Castrucci AM, Lamy-Freund MT, et al. High melatonin solubility in aqueous medium［J］. J Pineal Res. 1994 ,16(4):198-201.

［2］Costa EJ, Lopes RH, Lamy-Freund MT，et al. Permeability of pure lipid bilayers to melatonin. J Pineal Res. 1995,19(3):123-126.

［3］Otani H, Tanaka H, Inoue T, et al. In vitro study on contribution of oxidative metabolism of isolated rabbit heart mitochondria to myocardial reperfusion injury［J］. Circ Res. 1984,55(2):168-175.

［4］ Reiter RJ, Tan DX, Manchester LC, et al. Biochemical reactivity of melatonin with reactive oxygen and nitrogen species: A review of the evidence［J］. Cell Biochem Biophys, 2001,34:237-256.

［5］Flaherty JT, Weisfeldt ML. Reperfusion injury［J］. Free Radicals Biol Med. 1988,5(5-6):409-419.

［6］Reiter RJ. Melatonin: Lowering the high price of free radicals［J］. News Physiol Sci 2000,15:246-250.

［7］Tan DX, Reiter RJ，Manchester LC, et al. Chemical and physical properties and potential mechanisms: Melatonin as a broad spectrum antioxidant and free radical scavenger［J］. Curr Topics Med Chem 2002,2:181-198.

［8］Dugo L, Serriano I, Fulia F, et al . Effect of melatonin on cellular energy depletion mediated by peroxynitrite and poly(ADP-ribose)synthetase activation in an acute model of inflammation［J］. J Pineal Res, 2001,31:76-84.

［9］Yu BP. Cellular defenses against damage from reactive oxygen species［J］. Physiol Rev,1994 ,74(1):139-62.

［10］Reiter RJ, Tan DX, Manchester LC, et al. Melatonin reduces oxidant damage and promotes mitochondrial respiration:Implications for aging［J］. Ann NY Acad Sci, 2002,959:238-250.

［11］Antolin I, Rodriquez C, Sainz RM, et al . Neurohormone melatonin prevents cell damage: Effect on gene expression for antioxidant enzymes［J］. FASEB J, 1996,10:882-890.

［12］Okatani Y, Wakatsuki A, Shinohara K, et al. Melatonin stimulates glutathione peroxidase activity in human chorion［J］. J Pineal Res ,2001,30:199-205.

［13］Garcia JJ, Reiter RJ, Guerrero JM, et al. Melatonin prevents changes in microsomal membrane fluidity during induced lipid peroxidation［J］. FEBS Lett. 1997 May 26;408(3):297-300.

［14］Cuzzocrea S, Reiter RJ. Pharmacological action of melatonin in shock, inflammation and ischemia/reperfusion injury［J］. Eur J Pharmacol. 2001, 426(1-2):1-10.

［15］Gen W, Tani M, Takeshita J, et al. Mechanisms of Ca2+ overload induced by extracellular H2O2 in quiescent isolated rat cardiomyocytes［J］. Basic Res Cardiol,2001,96(6):623-629.

［16］Okatani Y, Watanabe K, Hayashi K, et al. Melatonin suppresses vasospastic effect of hydrogen peroxide in human umbilical artery: relation to calcium influx［J］. J Pineal Res,1997,22(4):232-237.

［17］Cuzzocrea S, Mazzon E, Serriano I, et al. Melatonin reduces dinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis［J］. J Pineal Res 2001,30:1-12.