市售正清风痛宁肠溶片在Beagle犬体内的相对生物等效性

摘要：目的探讨正清风痛宁肠溶片在Beagle犬体内的相对生物等效性。方法选用10只Beagle犬单剂量随机交叉口服正清风痛宁肠溶片受试制剂或参比制剂10mg・kg-1,用高效液相色谱法测定血药浓度，3p97软件计算药动学参数和并行相对生物等效性评价。结果受试制剂与参比制剂的药-时曲线呈一室模型，主要药动学参数Tmax分别为（86.25±10.61）min和（75.00±16.04）min，Cmax分别为（0.18±0.038）ug・ml-1和（0.18±0.042）ug・ml-1，AUC 0～T分别为（30.31±7.82）ug・min・ml-1和（32.09±8.61）ug・min・ml-1，受试制剂相对生物等效性为（94.45±5.49）%。结论经方差分析、单双侧t检验和非参数统计检验，表明受试制剂与参比制剂具有生物等到效性。

关键词：正清风痛宁肠溶片；高效液相色谱法、相对生物等效性

正清风痛宁肠溶片具有抗炎抗风湿、免疫抑制、镇静、镇痛的作用，已广泛应用于临床[1]。该制剂的主要成份是从传统治疗风湿性疾病中药清风藤提取的一种单体成分青藤碱（sinomenine）。有关青藤碱的药动学已有文献报道[2]，但其市售不同厂家肠溶片在Beagle犬体内的相对生物等效性未见文献报道，现将研究结果报道如下，供临床医生参考。

1资料与方法

1.1仪器Angilent1100高效液相色谱仪，Phenomenex Gemini C18色谱柱（4.6mm×250mm，5um）；VXH-3型快速混合器（上海跃进医疗器械厂）；PHS-3C酸度计（上海精密科学仪器有限公司）；B160A型医用低速离心机（河北省安新县白洋离心机厂）；BP61型电子天平（德国Sartorius公司）。

1.2药品和试剂①受试制剂，西安利君制药有限责任公司生产的正清风痛宁肠溶片（商品名为正清风痛宁片），规格：20mg/片，批号0707291。②参比制剂，湖南正清制药集团股份有限公司生产的的正清风痛宁肠溶片，规格：20mg/片，批号0803103。③青藤碱标准品，外观为白色结晶粉末，无臭，味苦，易溶于水，溶解于乙醇，纯度98%，西安赛邦医药科技有限公司提供，批号20070402。④内标物，去水吗啡，规格：5mg：1ml，沈阳第一制药厂，批号20020613。⑤二氯甲烷为色谱纯，其余试剂均为分析纯。 ⑥重蒸水（重庆医科大学附属医院药剂科）。

1.3动物合格Beagle犬10只，体重（10±0.8）kg，雌雄各半，四川养麝研究所提供，质量合格证号和环境设施合格证号SCXK(川)2008-01。

1.4方法

1.4.1给药方案与血样采集选择用10只Beagle犬，雌雄各半，随机分为受试制剂和参比制剂两组，每组5只，分别口服受试制剂或参比制剂，1w后两组动物交叉给药，给药剂量为试验前禁食12h后，按人与动物用量转换[4]，于次日8时空腹灌服受试制剂或参比制剂10.0mg・kg-1,于给药后0,15,30,60,90,120,240,

480min,从隐静脉取血2ml，肝素抗凝，分离血浆，低温保存（-20℃）待测。

1.4.2血药浓度测定方法

1.4.2.1色谱条件 PhenomenexGeminiC18色谱柱（4.6mm×250mm，5um），流动相为甲醇-0.01mol・L-1磷酸二氢钠-三乙胺（55：45：0.1，调pH至7），流速0.8ml・min-1；检测波长262nm；柱温30℃；内标去水吗啡；进样量50ul。

1.4.2.2青藤碱标准溶液的配制精密称取青藤碱标准品适量，用甲醇定容，配成300ug・ml-1储备液，于4℃保存。用前，用犬空白血浆按所需倍数稀释法稀释至所需浓度，得青藤碱的标准工作液。

1.4.2.3内标液的配制取去水吗啡液（5mg：1ml），用甲醇配为200ug・ml-1的储备液，于4℃保存。临用前，加蒸馏水稀释成40ug・ml-1，得内标工作液。

1.4.2.4样品处理取血浆样品0.4ml，加入去水吗啡内标50uL（40ug・ml）混合均匀，再行加入二氯甲烷4ml，漩涡混匀后置3500r・min-1离心机离心5min，等待静置分层，取有机层，置50℃水浴中氮气吹干，用流动相复溶100uL，每次进样50uL。

1.5数据处理药动学参数计算是采用3p97计算机软件。所得Cmax、Tmax用实测值表示；AUC0～T 用梯形法计算，口服给药的生物利用度 F=受试制剂（AUC0～T）/参比制剂（AUC0～T）×100%

2结果

2.1特异性在选定的色谱条件下，青腾碱和内标物质峰形好，与血浆中内源性物质及其他杂质分离良好，见图1，图A，B，C，D分别为青腾碱+去水吗啡对照品溶液，空白血浆，空白血浆+青腾碱+去水吗啡对照品，Beagle犬给药1h后血浆样品。

图1青腾碱HPLC图

A青腾碱+去水吗啡对照品溶液；B.空白血浆；C.空白血浆+青腾碱+去水吗啡；D.给药品1h后血浆样品[1.青腾碱;2.去水吗啡（内标）]

2.2标准曲线、线性范围和最低定量浓度分别取青腾碱标准溶液适量和犬空白血浆，配制质量浓度为0.0075，0.045，0.45，4.5，22.5，45，90ug・ml-1 的青腾碱血浆样品，按1.4.2.4项下方法进行样品处理并进样分析，所得数据以血浆中青腾碱的浓度X对青腾碱与内标的峰面积比值Y进行线性回归，得血浆中青腾碱的标准曲线为Y=0.3920X+0.7052（r=0.9991）。结果表明，青腾碱检测浓度在0.0075～90 ug・ml-1范围内线性关系良好，最低定量浓度为0.0075ug・ml-1(n=5,RSD=9.23%)。

2.3回收率和精密度取青腾碱回收液适量及犬空白血浆，制成高、中、低3种不同浓度（45，4.5，0.045ug・ml-1）样品，按1.4.2.4项下方法处理，评价本法的方法，回收率与萃取回收率（含药血浆经样品处理所得测定值与同时用流动相配制的同浓度标准溶液测定值，计算萃取回收率）及日内（每个浓度1d内测定5次）、日间精密度（每个浓度连续测5d，测1次/d），见表1。

2.4稳定性

2.4.1室温稳定性试验取中浓度（4.5ug・ml-1）血浆样品，室温放置，于24h内测定3次，结果表明室温放置24h内稳定性良好（青腾碱：4.42±0.20 ug・ml-1，RSD=4.52%）。

2.4.2冷藏稳定性实验取中浓度（4.5ug・ml-1）血浆样品，冷藏(4℃)放置，于6d内测定5次，结果表明冷藏放置6d内稳定性良好（青腾碱：4.68±0.23 ug・ ml-1，RSD=4.91%）。

2.4.3冻融稳定性试验将含药血浆反复冷冻（-20℃）、溶解，按样品处理后测定，3d内测定3次，测得青腾碱质量浓度分别为0.12，0.13，0.12ug・ml-1,结果表明血浆样品3d内反复冻融测定稳定性良好（0.12±0.0058ug・ml-1,RSD=4.8%）。

2.5血浆浓度则定结果受试制剂组和参比制剂组动物按10.0 mg・kg-1量单次口服相应制剂后的血浆按2.2.4项下方法处理后，以青腾碱峰与内标峰面积之比值代入标准曲线计算血药浓度，平均药-时曲线见图2。

图2 受试制剂与参比制剂的平均药-时曲线

2.6药动学参数与相对生物利用度受试制剂组与参比制剂组体内血药浓度的药-时数据经拟合后均为一室开放模型，其药动学参数见表2。受试制剂的相对生物利用度为（94.45±5.49）%。

2.7生物等效性评价采用受试制剂或参比制剂组的AUC（0～T）分别计算相对生物利用度（F）[2]。受试制剂的F（94.45±5.49）%。相对生物利用度主要参数AUC（0～∞）、AUC（0-T）和Cmax经方差分析，两药间无差异（P＞0.05）；双单侧t检验结果均等效；（1-2α）置信区间法统计均等效。

3讨论

文献报道，血浆内青藤碱采用高效液相色谱法检测，可选用三唑仑[3]、氯霉素[5]和氨基比林[6]作内标。经分析青腾碱结构，选择用结构类似物吗啡作内标较为满意；流动相中磷酸二氢钾换为磷酸二氢钠，各试剂比例为甲醇：磷酸二氢钠（55：45），结果稳定，简单易行，操作方便，完全能满足本研究条件。

青腾碱在家兔、Beagle犬体内药动学参数已有文献报道[2]。本研究结果所得药动学参数与文献报道类似。在Beagle体内受试制剂与参比制剂AUC（0-T）分别为30.31±7.82与32.09±8.61ug・min・ml-1,受试制剂的F为（94.45±5.49）%，与文献报道相类似。试验结果表明，青腾碱口服易于吸收，受试制剂与参比制剂生物等效。

参考文献:

[1]孔庆峰、李军.青腾碱研究新进展[J].中国中药杂志，2005，30（20）：1575.

[2]陈万一，周远大,何海霞.青腾碱在Beagle犬体内药动学和绝对生物利用度[J].中国中药杂志,2009；34(3)：1～4.

[3]张先洲，周延安，罗顺德,等.青腾碱凝胶剂的质量标准研究[J].医药导报，2003，22（8）：571.

[4]徐叔云，卞如廉，陈修,等.药理实验方法学[M].人民卫生出版社,2002:22.

[5]杨广德，刘军保、王志军,等.反相高效液相法测定血浆中青腾碱的含量[J].中国药学杂志，1993，28（3）：152.

[6]杨广德，刘军保，王志军,等.高效液相色谱法测定人血清和尿中盐酸青腾碱浓度及药代动力学研究[J].药学学报，1997，32（8）：620.