盐溶蛋白电泳法鉴定玉米种子纯度试验报告

摘要种子贮藏蛋白是种子基因表达的产物，可以反映遗传背景的差异。试验通过对玉米种子盐溶蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用其电泳谱带特征鉴定种子纯度。玉米盐溶蛋白电泳谱带可根据分子量大小划分为3个区域：α区、β区、γ区，其中β区是判断种子纯度的主要依据，α区其次，γ区影响不明显。结果表明，提取时间和样品浓度都对电泳有重要的影响，过氧化氢的加入量对电泳效果影响不大。同时，对实验中出现的其他技术问题进行探讨。

关键词玉米；盐溶蛋白；聚丙烯酰胺凝胶电泳；种子纯度

玉米是世界四大粮食作物之一，播种面积仅次于水稻和小麦。我国的玉米面积稳定在2 000万公顷左右，目前几乎全部是杂交种。从1993年的数据看，虽然播种面积比1992年减少了34.94万公顷，但产量却增加了732.1万吨（刘江等1994）[1]。玉米产量的提高当前主要是依靠优良杂交种的普及，而推广优良的杂交种需要大量优质种子。我国每年杂交玉米种植124.47万公顷左右，需用杂交种8~9亿千克以上[2-3]。杂交种中每混杂1%的自交系种子就会减产0.6%，种子纯度每提高1个百分点，可以增加产量225 kg/hm2，可见种子纯度的提高对玉米产量的增加具有重要的意义[4]。

品种纯度是指某一品种群体在特征、特性方面典型一致的程度，它是种子质量评价的重要指标，直接影响作物丰产性、稳定性、整齐一致性和抗性[5]。种子纯度检验包括真实性鉴定和纯度检验两个方面，其实质都是鉴定种子的基因型。目前，国内外普遍采用的鉴定方法有：形态学方法、生化方法和分子生物学方法[4，6]。盐溶蛋白电泳法鉴定玉米品种的纯度是基于玉米品种间蛋白组成的差异。该方法具有准确性高、分辨能力强、速度快、经济便捷、不受环境影响等优点，因而被列为行业标准（NY/T449-2001）[7]。本试验采用国标的方法鉴定玉米种子纯度，并分析了影响玉米盐溶蛋白聚丙烯酰胺电泳分离效果的主要因素及电泳操作中应注意的问题，为玉米纯度鉴定工作提供信息和依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验材料。玉米种子：益丰2号，冀农61号，泛玉2号，科河8号。

1.1.2试剂。丙烯酰胺、N-N＇亚甲基双丙烯酰胺、乳酸、乳酸钠、甘氨酸、抗坏血酸、氯化钠、蔗糖、甲基绿、三氯乙酸、过氧化氢、考马斯亮蓝R-250、冰醋酸、无水乙醇（化学试剂均为分析纯，水均为去离子水）。

1.1.3仪器。电泳仪（500±5V连续可调、0~400mA连续输出功率200W）、垂直板夹心式电泳槽、单粒粉碎器、天平（0.01g、0.001g、0.000 1g各1台）、pH试纸、高速离心机（5 000r/min以上）、电冰箱、微波炉、离心管（1.5mL）、离心管架、微量进样器、量筒、烧杯、玻璃棒。

1.2方法

1.2.1样品制备。参照国标（NY/T449-2001）作适当改进：从各样品中随机取种子，用单粒粉碎器粉碎，加入1.5mL离心管中，用滴管加入与样品体积相同的样品提取液，摇匀，放置5min后，再摇1次，30min后，用离心机5 000r/min离心15min，取上清液用于电泳。

1.2.2 凝胶制备。按照《玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法》（NY/T449-2001）规定制备。分离胶：丙烯酰胺11.25%，双丙烯酰胺0.375%；浓缩胶：丙烯酰胺6%，双丙烯酰胺1%。

1.2.3电泳。在500V电压下稳压电泳，待甲基绿指示剂移至胶底部边缘时，关闭电源。

1.2.4染色。倒出电极缓冲液，取出胶室，卸下胶条，启开玻璃板，取出胶片，浸入染色液中，室温染色4h。若希望染色速度加快，也可适当提高温度。

2结果与分析

2.1玉米盐溶蛋白的谱带特征

大多数种子贮藏蛋白在多基因位点上编码，基因产物显示几条蛋白带（黎裕，1990）[8]。在品种鉴定中，可根据特定蛋白带的有无或者在电泳凝胶上某一位置出现的谱带评价其特异性（见图1）。不同的玉米品种由不同的蛋白质组成，所以表现在电泳谱带上就有不同的谱带类型，玉米盐溶蛋白电泳就是利用这些差异来鉴定品种的。

玉米盐溶蛋白电泳谱带可根据分子量大小划分为3个区域：α区、β区、γ区。α区由小分子量蛋白质组成，β区由中分子量蛋白质组成，γ区由高分子量蛋白质组成。

β区为主要的谱带区域，该区域中蛋白质谱带数量多，染色深，品种间差异大，为纯度鉴定中主要应用区。

α区为次谱带区域，该区域中蛋白质谱带数量少，谱带扩散，染色浅，品种间差异不太显著。在纯度鉴定中，当β区域谱带差异不明显时，可根据α区域的谱带差异进行鉴定。

γ区为辅助区，该区域中蛋白质谱带数量多，染色谱带细，易受电泳条件影响。对于虫蛀、发霉、生病的籽粒，该区域谱带会部分或全部消失。在该区域品种间差异较小，不太容易观察，最好不作为纯度鉴定时用。如果α区和β区无差异，只有γ区有差异时，最好严格控制操作条件，以达到良好的重复性[10]。

该品种α区和β区很明显，谱带多态性丰富，图谱清晰，分辨率高，它的主要谱带区域即β区很明显。因此，我们以后用此方法鉴定玉米纯度时，主要看β区的明显特征，如果不清晰，再看α区特征，对于γ区可以不作为鉴定标准。我们可以设想，给每个地方的品种建立一个凝胶电泳图谱库，把每个品种的特征谱带找出来，这样鉴定种子纯度时就可以从图谱中直接查找匹配的图谱，以快速鉴定，并且可以判断出混入了哪些品种[10]。

2.2玉米盐溶蛋白电泳的影响因素探讨

2.2.1玉米盐溶蛋白的提取。提取样品中的蛋白质时提取液加入后要充分摇匀，然后进行离心。本实验通过对比发现，提取液加入后充分摇匀，放置10min左右再摇匀1次，再离心提取的效果较好，蛋白的提取量较高，电泳的谱带较丰富。

2.2.2提取时间对电泳效果的影响。保持凝胶组分的浓度不变，将提取时间改变。结果表明，提取时间太短，蛋白浓度太低，染色后，谱带颜色较浅，影响分辨率；提取120min后，部分蛋白质水解，谱带丢失；提取时间分别为30min和50min时，蛋白质组分多态性丰富，谱带清晰，分辨率高。因此，一般提取时间选为30~50min之间。

2.2.3提取液放置4℃冰箱对电泳分离效果的影响。将提取35min、离心10min后的样品放置于4℃冰箱，1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d后分别对此样品进行电泳，结果表明，放置后，电泳谱带没有变化，可以继续使用，这与张春庆等做的结论是一致的[11]。因此，在实际工作中既可提前提取，也可在电泳前提取。

2.2.4提取液用量对电泳结果的影响。在样品制备中，加入不同体积的提取液。提取液加入过多，电泳谱带颜色较浅，原因是样品中蛋白浓度低，因此染色较浅；提取液加入太少，加样时微量加样器会吸取到少量种子面粉颗粒，导致谱带颜色过深。

2.2.5过氧化氢加入量对凝胶聚合速度的影响。过氧化氢作为凝胶聚合的加速剂，对凝胶聚合速度有直接影响，其加入量越大，凝胶聚合越快。本实验对过氧化氢加入量设置不同组合，验证它对电泳结果的影响，同时找出最佳的过氧化氢用量。结果表明，选用6mL浓缩胶中加入50μLH2O2，18mL分离胶中加入25μLH2O2时，电泳效果较好，谱带清晰。一般随着催化剂用量的递增，缩短凝胶聚合时间，进样小井残留液减少，凝胶板硬度略有增加，在以后的操作中不易破裂。

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2.2.6凝胶粘板。主要是玻璃板不干净。因此，清洗玻璃板时首先要用软毛刷把板上的凝胶清除干净，避免划拨玻璃板，然后再用海绵等软的物品清洗，清洗干净后要用蒸馏水冲洗两面，垂直放在玻璃板架上自然晾干。若粘板严重要更换新的玻璃板[12]。

2.2.7谱带的弯曲现象。灌分离胶时加过氧化氢进行催化，若过氧化氢在分离胶中分布不均匀，会导致胶体聚合不匀而引起谱带弯曲。在灌分离胶时，一定要充分搅拌，用力摇匀后再灌[13]。

3讨论

大多数种子贮藏蛋白在多基因位点编码，基因产物显示几条蛋白带（黎裕，1990）[7]。在品种鉴定中，可根据特定蛋白带的有无或在电泳凝胶上某一位置出现的谱带评价其特异性。玉米盐溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）鉴定玉米种子纯度，谱带多态性丰富，且结果与田间种植纯度鉴定方法结果一致[14]。因此，盐溶蛋白PAGE法可以作为玉米纯度检验的可靠方法。标准的、实施给种子质检中心、广大种子经销商提供了一套快速、实用的室内纯度检测方法，具有成本低、速度快、鉴定周期短等特点，解决了种子流通领域过程中经常出现的种子质量问题，避免了不必要的损失，减轻了农民负担。该方法具有田间种植不可比拟的优越性，对于广大使用者来说具有重要的应用价值，同时也创造了较好的经济效益和社会效益。但是，任何一个标准的推广应用都是一个不断修改、补充、完善的过程，随着时间的推移，本标准将会逐步完善并且越来越显示其重要的应用价值[15]。

4参考文献

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[2] 李家义.国际种子检验规程[M].上海：上海科学技术出版社，1995.

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[6] 汪旭明.杂交玉米种子纯度计算机视觉鉴别技术研究[D].沈阳：中国科学院沈阳自动化研究所，2000：14.

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[10] 辛景树，赵建宗.杂交玉米种子纯度快速鉴定技术及应用前景[J].中国种业，2002（4）：4-5.

[11] 张春庆，金锡奎，郑成超.NAU-PAGE技术与玉米种子纯度测定[J].中国农业科学，1995，28（6）：20-24.

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[13] 向东山.盐溶蛋白电泳法鉴定玉米种子纯度试验中的几个问题[J].内蒙古农业科技，2006（2）：34.

[14] 方玉春，张兴和，刘俊平，等.利用田间种植鉴定法验证室内玉米盐溶蛋白PAGE电泳法的准确性[J].玉米科学，2002，10（3）：48-49.

[15] 颜廷进.关于玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法的几点建议[J].种子科技，2003（3）：212.

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