枸杞多糖对NK细胞杀伤活性的影响

【中图分类号】R733.7【文献标识码】A【文章编号】1672－3783(2012)03－0343－01

【摘要】目的：观察枸杞多糖作用前后人白血病细胞株HL-60表面MICA的表达变化及对NK细胞杀伤活性的影响，为白血病免疫治疗打下实验基础。方法：用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测不同浓度枸杞多糖作用前后HL-60细胞培养上清中MICA的浓度；MTT法对不同浓度枸杞多糖作用前后NK细胞对HL-60杀伤活性的变化进行检测。结果：ELISA检测显示不同浓度枸杞多糖（6mg/ml,8mg/ml,10mg/ml）作用后HL-60细胞培养上清中MICA的浓度分别为(18.314±0.926)ng/l;(22.049±1.207)ng/l;(27.509±1.859)ng/l与作用前浓度(11.226±0.652)ng/l相比,差异有统计学意义 （P

【关键词】枸杞多糖；白血病细胞株HL-60； NK细胞；MICA ；白血病；杀伤活性

急性白血病（AL）是造血干细胞的恶性克隆性疾病，目前治疗包括传统的化疗、放疗、造血干细胞移植及新兴的分子靶向治疗和免疫治疗。各种方法因其有不同的局限性在临床上受到限制。近年来，免疫治疗已经成为白血病尤其是对微小残留病灶清除的研究热点，并取得了一定成功。

NK细胞是机体固有免疫的主要细胞，在肿瘤免疫中构成了第一道防线，N K细胞对靶细胞的杀伤活性与其细胞表面的受体和靶细胞表面的配体密切相关。［1］NK细胞对HL-60细胞具有一定的杀伤活性，但杀伤活性不高，需要大量的NK细胞才能达到治疗要求。而目前体外大量扩增NK细胞的技术还处于实验阶段。如何激活NK细胞活性并扩大其群体是研究NK细胞的重要问题。研究表明MICA表达阳性的肿瘤细胞对NK细胞的杀伤敏感性明显高于MICA阴性者。［2］因此，NKG2D结合MICA可介导NK细胞的杀伤活性。中药在抗肿瘤方面显示出了明显的优势，某些多糖成分（云芝多糖，灵芝多糖等）可通过激活NK细胞达到抗肿瘤作用。枸杞多糖(LBP)是传统中药材枸杞的主要成分之一，有增强机体免疫力，抗肿瘤等作用。有关枸杞体外抗瘤作用的报道较少，据此，本实验以枸杞多糖体外调节NK细胞为研究，观察枸杞多糖能否上调人白血病细胞株HL-60表面MICA的表达率,是否能增强NK细胞的杀伤活性，进而探讨NK细胞对白血病免疫治疗的新途径。

1 材料

1.1 培养液和试剂：RPMI-1640（Gibco公司）,胎牛血清（杭州四季青公司）,NK细胞 (兰州大学医学实验中心)， HL-60 (兰州大学医学实验中心)，枸杞多糖(咸阳瑞欣生物技术有限公司)，人组织相容性复合体1类相关基因A（MICA）酶联免疫分析试剂盒（R&D公司）,噻唑兰（MTT）（科昊生物工程有限责任公司）。

1.2 细胞培养:NK细胞接种在含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基中，置于37℃，5%CO2的培养箱中培养，每4～5d进行换液，传代培养；HL-60细胞培养于含10 ％的胎牛血清RPMI1640完全培养基中，置于37℃，5%CO2 培养箱中培养，每3d进行换液，传代培养，8代以内用于实验。

2 实验方法

2.1 方法：（1）ELISA检测不同浓度的枸杞多糖作用前后HL-60细胞培养上清中MICA的浓度

收集HL-60细胞，低速（600r/min）离心5min，弃上清,取6孔板接种HL-60细胞5×106/孔，分别 加入终浓度为6,8,10mg/ml的枸杞多糖，每组设立一个复孔进行对照，置于37℃、5%CO2培养箱培养48h。48h后取HL-60细胞，高速（2800r/min）离心20min，收集细胞培养上清液，取100μL细胞上清标本，采用双抗体夹心ELISA法检测培养上清液中MICA的含量，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

（2）MTT法对不同浓度枸杞多糖作用前后NK细胞对HL-60杀伤活性的变化进行检测

HL-60 用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基培养。收集细胞，低速（600r/min）离心5min，弃上清, 调整细胞浓度在5×106个/ml左右，接种于6孔培养板中，每孔1ml，分别加入终浓度为6,8,10mg/ml的枸杞多糖，每组各设立一个对照孔，置于37℃、5%CO2培养箱中培养48h。分别收集HL-60细胞和三种浓度枸杞多糖作用后的HL-60细胞，作为靶细胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基调整细胞密度为1×104/mL，加于96孔板中，每孔50ul,在37℃、5%CO2培养箱中培养24h。以NK细胞作为效应细胞，收集NK细胞，低速（800r/min）离心10min，弃上清,按照效靶比5：1,10:1，20: 1调整细胞浓度，各取50uL效应细胞加入含有靶细胞的孔中，置于37℃、5%CO2培养箱中混合培养20h，无菌条件下每孔依次加入MTT10ul，1mol/LHCL-10%SDS溶液，置于37℃、5%CO2培养箱中过夜,使沉淀充分溶解. 同时设立单纯效应细胞孔，单纯靶细胞孔，完全培养基调零孔（100μl10%胎牛血清RPMI1640完全培养液），空白对照孔（10ul10%的胎牛血清RPMI1640完全培养液和90μL三种浓度枸杞多糖溶液）。通过全自动酶标分析系统检测570nm波长处各孔的吸光度值(OD值),根据杀伤活性计算公式：杀伤率=【1-(Ae+t-Ae)/At】×100% 3Ae+t:杀伤孔(效应细胞+靶细胞)A值; Ae：相应浓度的效应细胞对照孔A值,At: 靶细胞对照孔，计算NK细胞杀伤活性。

2.2 统计学分析

所用数据以均数±标准差( x±s)表示，采用SPSS11.0软件分析，各组间进行单因素方差分析，进一步的两组间的多重比较采用LSD-t检验。

3结 果

3.1 枸杞多糖作用前、后HL-60细胞表面MICA的表达情况

不同浓度枸杞多糖作用前后，HL-60细胞培养上清中MICA的浓度见表1。结果显示：随着枸杞多糖浓度的增高，HL-60表面MICA的含量逐渐增高。

3.2NK细胞对枸杞多糖作用前后HL-60细胞杀伤活性的测定

效靶比5:1、10:1、20:1时，枸杞多糖作用前，NK细胞对HL-60细胞的杀伤率分别为（13.64±0.25）%、（22.41±0.36）%、（31.72±0.62）%；NK细胞对6mg/mL浓度的枸杞多糖作用后HL-60细胞杀伤率分别为（19.59±0.47）％、（27.46±0.83）%、（38.43±1.68）％；NK细胞对8mg/mL浓度的枸杞多糖作用后HL-60细胞杀伤率分别为（27.86±0.75）%、（39.30±1.86）%、（48.94±2.80）%；NK细胞对10mg/mL浓度的枸杞多糖作用后HL-60细胞杀伤率分别为（34.50±1.20）%、（41.28±2.38）%、（51.02±3.72）%（见表2）。结果显示：枸杞多糖可增强NK细胞的杀伤性，并与其浓度成正比。

讨论：得到完全缓解的急性髓细胞白血病(AML)患者由于微小残留病灶而复发，只有不到40%的AML患者能长期生存，［3］因此由免疫系统监视清除MDR是白血病免疫治疗的主要目标。NK细胞不用预先致敏,也不受主要组织相容复合物的限制,就可识别并杀灭某些肿瘤细胞和病毒感染细胞，其功能受其表面的激活性受体和抑制性受体之间平衡机制的调节. 正常情况下，NK细胞通过表面的抑制性受体识别自身的MHCI类分子，保护正常细胞免受NK细胞的攻击。［4］NK细胞的活化受体NKG2D是C型凝集素超家族中的一员，不仅在所有NK细胞均有表达，而且表达于CD8+T及、活化的巨噬细胞表面。MICA 作为NKG2D的主要配体,主要在大多数上皮源性肿瘤细胞上表达，如卵巢癌、结肠癌、白血病等。NKG2D与MICA的结合决定NK细胞的杀伤活性。

白血病免疫治疗旨在激活患者的免疫反应，能够有效地清除微量残留白血病细胞。据报道,IL-2 具有活化 NK细胞的作用,但大量 I L-2对机体有毒性反应，使临床应用受限制。枸杞富含微量元素，具有免疫增强功效，有报道表明，枸杞多糖能增加免疫抑制动物Th细胞的数量，提高Th/Ts比值，调整T细胞亚群紊乱状态。而且能使免疫抑制动物的细胞转化率上升。［5］本实验系统观察了枸杞多糖作用前后HL-60细胞表面MICA的表达变化，结果显示MICA的表达与枸杞多糖的浓度成正比，进一步研究显示枸杞多糖通过上调HL-60细胞表面MICA的表达，能增强NK细胞的杀伤活性，且与浓度成正比。中药枸杞具有广阔的开发利用前景，对白血病免疫治疗具有主要的意义。

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