时间：2022-08-07 05:27:55
[摘要]研究了植物生长调节剂氯吡脲（CPPU）的1×10-6，0.67×10-6，0.5×10-6清水稀释液对五味子Schisandra chinensis的果实形态和有效成分木脂素的影响。结果表明，CPPU叶面微肥促进了五味子果穗横径生长，抑制了果穗纵径生长。同时，3种不同浓度CPPU清水稀释液对五味子千粒重，产量均有不同程度的提高，其中0.5×10-6CPPU千粒重，产量最大，1×10-6次之，0.67×10-6提高的最少。通过测定不同采收期CPPU处理的五味子6种木脂素含量表明，木脂素含量的主要积累期在幼果期到半成熟果期，0.67×10-6的氯吡脲清水稀释液有利于五味子醇乙、五味子丙素、五味子乙素的积累。在五味子临床需求较大的今天，对CPPU胁迫对五味子的研究应予以高度重视。
[关键词]氯吡脲；五味子；木脂素；果实形态
氯吡脲[forchlorfenuron，化学名称1-（2-氯-4-吡啶）-3′-苯基脲]，简称CPPU，是一种植物生长调节剂。CPPU在农业方面应用较广，周永丰等[1]报道了0.1%的氯吡脲是一种理想的甜瓜生产调节剂，值得在生产中广泛应用，许如意等[2]报道了0.1%氯吡脲可溶性液剂的浓度为100倍时能促进丝瓜“玉翠”座果，并能增加2个品种的维生素C和可溶性糖的含量，表明氯吡脲是一种较理想的丝瓜生长调节剂，可在丝瓜生产中推广应用，李佳等[3]对黄瓜消解动态的研究表明，CPPU在黄瓜中消解较快，黄瓜收获时（施药后40 d），样品中未检出CPPU残留，Kobayashi[4]检测了63种蔬菜和19种水果发现，没有一种农作物被检测出CPPU。
五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis（Turez. ） Baill. 的干燥成熟果实，味酸、辛、微苦，功效收敛固涩，益气生津，补肾宁心[5]。五味子中含有的多种木脂素成分被认为是五味子最主要的药理活性成分，具有保肝[6]、抑制中枢系统[7]、抗肿瘤[8]、抗炎[9]、抗氧化[10]等药理作用，其中经人工合成提炼的有效成分五味子丙素经人工合成提炼而成“联苯双酯”已在临床应用于治疗肝炎。关于CPPU对五味子果实形态、千粒重、产量、木脂素含量的影响未见报道。
本研究以辽宁中医药大学五味子试验田五味子为材料，进行氯吡脲多水平试验，通过测定五味子果实形态指标和6种木脂素含量的测定，揭示氯吡脲水稀释液叶面喷施处理对五味子形态、产量、各个木脂素不同采收期含量的影响，以期为进一步阐述氯吡脲对五味子品质的影响提供科学依据。
1材料
氯吡脲胁迫试验于2012年5月至12月在辽宁省盖州市高屯镇高屯村五味子试验田进行，该地区气候类型为暖温带大陆性季风气候，平均海拔82 m，北纬40°26′19.2″，东经122°36′17.6″，年平均气温8.8 ℃，平均有效积温3 743.6 ℃，总降水量528.8 mm，初霜10月22日，终霜4月16日，土壤质地为壤土，土壤中铵态氮17 mg・kg-1，速效钾159 mg・kg-1，速效磷57 mg・kg-1，排灌方便。选择长势较一致的四年生五味子进行胁迫试验。试验材料为五味子的果实，采集时间为6月到11月底，自然阴干，粉碎。试验采用随机区组设计，共设4个处理，处理1为空白组清水处理组，处理2为氯吡脲1×10-6处理组，处理3为氯吡脲0.67×10-6处理组，处理4为氯吡脲0.5×10-6处理组。各处理组于2012年5月23日进行叶面喷施，喷施时，主要细致地喷于叶子的背面，要先上后下，先里后外，喷至有滴液为止。分别于喷施后的13，83，126，147，184 d即2012年6月5日，2012年8月16日，2012年9月29日，2012年10月20日，2012年11月27日采集五味子果实作为样品进行木脂素含量测定。
仪器：Agilent 1100 型高效液相色谱仪（Agilent 公司） ，KQ-250型超声清洗器（昆山超声仪器有限公司），电子天平（瑞士 Mettler Toledo AG285、AE240），粉碎机（屹立牌），SL-2D型土壤养分测试仪（北京顺龙科技发展有限公司）；游标卡尺；电子称（SF-400A）；GPS。
试剂：氯吡脲为四川省兰月科技开发有限公司好得美0.1%氯吡脲；对照品五味子醇甲（110857-200507）、五味子甲素（110764-200609）、五味子乙素（110765-200710）、五味子酯甲（111529-200503）（购自中国食品药品检定研究院）、五味子醇乙、五味子丙素（购自成都思科华生物技术有限公司），供含量测定用；甲醇为分析纯和色谱纯、乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水。
2方法
2.1五味子果实指标的测定
分别在喷施后的18，38，85 d即2012年6月11日，2012年7月1日，2012年8月17日，用游标卡尺测量同等高度光照强度近似的五味子果穗的横径和纵径的大小，共测量3次。分别在喷施后113 d，即2012年9月16日，采同等高度同等光照的五味子果穗10～15穗，用电子称对果实称重，计算千粒重；采收各处理组三分之一果实，用便携式电子称称量，估算产量。
2.2五味子6种木脂素成分的测定
2.2.1 色谱条件 采用Agilent TC- C18 （4.6 mm ×250 mm，5 μm） 色谱柱，流动相为乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～17 min，50% A；17～25 min，50%～55% A；25～32 min，55%～75% A； 32～37 min，75%～70%A；37～42 min，70%～65% A；42～47 min，65%～50% A），流速 1.0 mL・min-1，检测波长 217 nm，柱温 30 ℃，进样量 10 μL，HPLC图见图1。
2.2.2 溶液的制备对照品溶液 分别称取对照品五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素适量，精密称定，色谱甲醇超声溶解，补足失重，并定容至25 mL量瓶中，经过0.45 μm的微孔滤膜，依次得到质量浓度分别为0.205 2，0.209 2，0.213 2，0.197 6，0.203 6，0.202 8 g・L-1的对照品溶液，备用。再分别精密吸取五味子醇甲400 μL、五味子醇乙100 μL、五味子酯甲100 μL、五味子甲素100 μL、五味子乙素200 μL、五味子丙素20 μL，置于1.5 mL EP管中，加甲醇80 μL混合均匀成混合对照品，备用。
2.2.3 供试品溶液 取干燥后的五味子果实粉末（干燥至恒重，50 目）约0.25 g，精密称定，置于25 mL量瓶中，精密加入甲醇23 mL，30 ℃超声30 min，取出，冷却至室温，加甲醇定容至刻度线，摇匀，0.45 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.3数据统计
数据处理采用Excel和SPSS 19.0，并使用SPSS 19.0进行方差分析，差异显著性检验采用LSD法进行多重比较。
3结果
3.1氯吡脲叶面微肥的不同处理对不同发育时间五味子果实的纵、横径变化特征
五味子果穗纵横径不同时期的差值，即净生长量的变化可以看出，CPPU处理组的五味子横径的生长量大于空白处理组，根据8月17日和6月11日的纵横径变化得出，五味子经CPPU处理后的综合作用是，促进了果穗横径的生长，抑制了果穗纵径的生长，说明CPPU叶面微肥对五味子果穗生长具有调节作用，即对果穗横径生长的促进，可能是由于对纵径生长的抑制引起的，见表1。
3.2氯吡脲叶面微肥的不同处理对五味子千粒重和产量的影响
经CPPU处理的五味子果实的千粒重都较空白组大，这说明经CPPU处理的五味子在促进横径增长的同时，也促进了果实的质量，经CPPU清水稀释液处理的五味子的产量极显著高于空白组五味子。统计分析，处理间差异极显著，进一步进行多重比较，CPPU3种清水稀释液与对照之间差异都极显著。对产量性状进行分析，氯吡脲胁迫的果实千粒重都较对照高，产量的增加部分来源于单个果实的质量，见表2。
3.3不同氯吡脲胁迫对五味子果实6种木脂素类成分积累的影响
3.3.1 氯吡脲胁迫下五味子醇甲含量的影响 五味子醇甲含量见图2，6月5日五味子醇甲的含量较其他采收时间含量都低，五味子醇甲质量分数最高为7.213 mg・g-1，是含量最低的12.95倍，这说明五味子醇甲含量的积累主要在6月5日到8月16日。
3.3.2 氯吡脲胁迫下五味子醇乙的含量 不同CPPU胁迫下，不同时期五味子中五味子醇乙含量差异较大，见图2。6月5日五味子醇乙的含量较9月29日，10月20日、11月27日低，差异显著，与8月16日差异不显著；8月16日较9月29日五味子醇乙含量低，差异极显著，与其他采收期之间差异都不显著；10月20日、11月27日与08月16日、9月29日之间五味子差异都不显著。可见，五味子醇乙含量快速积累期在6月5日到8月16日。除9月29日外，处理2全部高于对照和其他处理，可见0.67×10-6的CPPU最有利于五味子醇乙的积累。
3.3.3 氯吡脲胁迫下五味子酯甲的含量 不同CPPU胁迫下，不同时期五味子中五味子酯甲含量差异较大，见图2。6月5日五味子酯甲较其他采收期五味子酯甲含量都低，6月5日与8月16日五味子醇甲含量差异不显著，9月29日五味子酯甲含量较6月5日高0.639 mg・g-1，差异显著。可见，五味子酯甲含量的积累期在6月5日到9月29日，9月29日之后五味子酯甲的含量基本趋于稳定。如图可以看出不同处理的五味子酯甲的含量时高时低，可见，氯吡脲胁迫对五味子酯甲含量的积累不具规律性。
3.3.4 氯吡脲胁迫下五味子甲素的含量 不同CPPU胁迫下，不同时期五味子中五味子甲素含量差异较大，见图2。6月5日五味子甲素含量较其他采收时间都低，并且差异显著，其他采收时间五味子甲素含量差异不显著，五味子甲素含量最高的为11月27日对照组2.076 mg・g-1是含量最低的6月5日对照组五味子甲素的45.13倍。可见，五味子甲素含量的快速积累期在6月5日到8月16日。除6月5日外，对照高于全部处理，可见，氯吡脲胁迫处理并未促进五味子甲素含量的积累。
3.3.5 氯吡脲胁迫下五味子乙素的含量 不同CPPU胁迫下，不同时期五味子中五味子乙素含量差异较大，见图2。6月5日五味子乙素含量较其他采收时间都低，并且差异显著，五味子乙素质量分数最高的为11月27日空白组3.709 mg・g-1，是含量最低的6月5日空白组五味子乙素的9.23倍。可见，五味子乙素含量的快速积累期在6月5日到8月16日，8月16日之后五味子乙素的含量基本趋于稳定。除11月27日，处理2五味子乙素含量都较其他处理组高，可见，0.67×10-6的氯吡脲清水稀释液有利于五味子乙素的积累。
3.3.6 氯吡脲胁迫下五味子丙素的含量 不同CPPU胁迫下，不同时期五味子中五味子丙素含量差异较大，见图2。五味子丙素的快速积累期在11月27日到8月16日，差异显著。除8月16日，处理2五味子丙素含量最高，可见，0.67×10-6的氯吡脲清水稀释液有利于五味子丙素的积累。
4讨论
4.1五味子样品中氯吡脲HPLC的检测
齐明芳[12]对甜瓜果实中氯吡脲的残留分析表明，在开花时施用氯吡脲处理，至花后25 d已完全分解，无残留影响。本研究采用HPLC法检测了五味子样品中氯吡脲的含量残留，色谱条件为Agilent TC- C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm） 色谱柱；流动相甲醇-水60∶40；进样体积10 μL；流速 1.2 mL・min-1；检测波长 265 nm；柱温 40 ℃[13]。结果表明，在幼果时施用氯吡脲处理，无残留影响。
4.2氯吡脲胁迫对五味子果实形态的影响
CPPU对五味子果实形态的影响表现在抑制其纵径的增长，促进其横径的增长。王英杰等[14]对CPPU促进巨峰葡萄果粒肥大的机制研究发现，氯吡脲通过促进细胞的数量和细胞的体积而使葡萄的果粒膨大，Kurosaki等的研究表明，氯吡脲处理的猕猴桃细胞的大小并没有变化，果实的增大来源于细胞数量的增加。本研究结果显示，1×10-6，0.67×10-6，0.5 ×10-6CPPU均可以促进五味子的横向增长，抑制五味子纵向的增长，说明CPPU有可能是通过增大果肉细胞的横向生长，抑制了果肉细胞的纵向生长引起的，这还需要对CPPU处理的五味子进行进一步的细胞学观察来证明。
4.3氯吡脲胁迫对五味子千粒重和亩产量的影响
孙瑞红等[15]报道了0.1%氯吡脲处理的葡萄平均单果重增加了0.5～1.06 g，增产效果达20.2%，周永丰等[1]报道了0.1%氯吡脲可溶性液剂可显著提高甜瓜坐果率，从而提高甜瓜的产量。本研究结果表明，0.1%氯吡脲的不同稀释倍数的五味子也表现出了千粒重的提高和五味子产量的提高。本研究表现出了0.1%的氯吡脲随着稀释倍数的增高，千粒重和产量增高。
4.4五味子6种木脂素对氯吡脲胁迫的响应
本研究采取HPLC对5个不同采收期的1×10-6，1.5×10-6，2×10-6氯吡脲胁迫条件下的五味子6种木脂素含量进行了测定。研究结果显示，1.5×10-6氯吡脲胁迫有助于五味子乙素、五味子丙素含量的积累，对其他4种五味子木脂素含量的积累不起促进作用。联苯双酯是用中药五味子的有效成分五味子丙素经人工合成提炼而成[16-17]，在临床已广泛由于治疗应用于治疗肝炎[18-22]，但是有报道联苯双酯停药后会有停药反应[23-25]，本研究得出1.5×10-6氯吡脲能够促进五味子丙素的积累，这将具有重大的应用价值。赵等[26]报道了不同生长期五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素的总量在半成熟果期含量最高。本研究中，五味子酯甲含量的积累期主要在6月5日到9月29日，即幼果到成熟果期，之后含量基本稳定，而其他5种木脂素五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素含量的积累期主要在6月5日到8月16日，即幼果到半成熟果期，之后含量基本稳定。
总而言之，中药材的有效成分是植物在生长过程中产生的次生代谢产物，而次生代谢产物的产生主要是植物在逆境条件下为了更好的适应生存而形成的特殊保护代谢物质，五味子对不同浓度的氯吡脲其果实形态、千粒重、产量、6种木脂素的含量表现不同的响应。本研究结果表明，氯吡脲对五味子的胁迫应引起足够的重视。
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Effect of forchlorfenuron on fruit morphology and lignans
content of Schisandra chinensis
SONG Xin， DING Pu， LI Xian-kuan， CHEN Ting， CHEN Liang， WANG Bing*
（Liaoning Universtity of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China）
[Abstract] The effect of plant growth regulator forchlorfenuron （CPPU）1×10-6， 0.67×10-6， 0.5×10-6 on fruit morphology and effective components lignans was studied. Those morphologies were the combination of four basic morphological changes. The result showed， diametre were increased and longitudinal diametre of fruits were inhibited by foliage fertilizers including CPPU. At the same time， 1 000-grain weight and yield showed the varying degrees increase under CPPU. The order of the degree was 0.5×10-6>1×10-6>0.67×10-6. Six lignans content of Schisandra chinensis of different harvest time and different CPPU processing groups were determined， the results showed that lignans accumulation occurred mainly in periods of premature the half mature fruiting stages. Under the 0.67×10-6 CPPU treatment， schisandrol B， schisandrin B， schisandrin C content of S. chinensis showed different increase.
[Key words] forchlorfenuron； Schisandra chinensis； lignans； fruit morphology
doi：10.4268/cjcmm20140907