医学生社会实践论文：皮肤鳞癌组织中MMP

【关键词】皮肤肿瘤；免疫组织化学；明胶酶B；抗原CD34；微血管密度

ExpressionofMMP9inskinsquamouscellcarcinomaanditssignificanceinmicroangiogenesis

【Abstract】AIM:TodetecttheroleandthesignificanceofMMP9inmicroangiogenesisinskinsquamouscellcarcinoma(SCC)andtoobservetherelationbetweentheexpressionofMMP9andmicrovesseldensity(MVD)inSCC.METHODS：ImmunohistochemicalSPstainingwasusedtoexamineMMP9expressionandthechangeofMVDunderlightmicroscopein45casesofSCC,19casesofBowendisease,and10casesofnormalskin.RESULTS：TheexpressionofMMP9inSCCgroupwassignificantlyhigherthanthatinBowendiseasegroup（P<0.05）,whilethelatterwasalsosignificantlyhigherthanthatinnormalskingroup（P=0.028，P<0.05）.ThelevelofMVDinSCCgroupwassignificantlyhigherthanthatinBowendiseasegroup（P<0.05）,andthelatterwassignificantlyhigherthanthatinnormalskingroup（P<0.05）.CONCLUSION：MMP9ishighlyexpressedinSCC,andmaybeoneofimportantfactorsinangiogenesisofSCC.

【Keywords】skinneoplasms;carcinoma,squamouscellimmunohistochemistry;gelatinaseB;antigens,CD34;microvesseldensity

【摘要】目的：探讨皮肤鳞状细胞癌（SCC）发生发展过程中基质金属蛋白酶9（MMP9）对微血管生成的意义.方法：SCC45例,Bowen病19例、正常皮肤10例进行CD34,MMP9免疫组化染色.检测MMP9的表达和微血管密度（MVD）的变化，分析MMP9的表达与MVD之间，及它们与SCC临床病理特征之间的关系.结果：在SCC组中MMP9表达高于Bowen病组（P<0.05）,Bowen病组中MMP9表达高于正常皮肤组（P=0.028,P<0.05）.在SCC组中MVD值高于Bowen病组(P<0.05)，Bowen病组中MVD值高于正常皮肤组（P<0.05）.结论：MMP9可能是SCC促进微血管生成因子之一，与SCC的侵袭性相关.

【关键词】皮肤肿瘤；免疫组织化学；明胶酶B；抗原CD34；微血管密度

0引言

癌细胞侵袭和转移能力与其诱导产生蛋白酶降解细胞外基质（ECM），基底膜（BM）的能力密切相关.基质金属蛋白酶（MMP）是其中最为重要的一组蛋白酶，研究表明［1-2］，MMP对肿瘤的侵袭和转移起重要的作用.Guttman等［1］研究表明MMPs在肿瘤血管生成中也有重要作用.明胶酶是MMPs的一个亚类，包括基质金属蛋白酶2（MMP2）和基质金属蛋白酶9（MMP9），近年MMP9与肿瘤血管生成的关系逐渐被重视.MMP9不仅是降解基底膜和ECM的关键酶，而且在肿瘤间质血管生成中起重要作用.在皮肤鳞癌中，有关MMP9的研究报道很少，其结果也不完全一致.我们通过免疫组织化学技术检测Bowen病(BD)，鳞状细胞癌（squamouscellcarcinoma,SCC）组织中MMP9和CD34的表达，并对MMP9的表达与微血管密度（MVD）做定量分析，探讨皮肤鳞状细胞癌、Bowen病、基底细胞癌组织中MMP9对血管生成的作用及其临床意义.

1材料和方法

1.1材料石蜡包埋组织标本选自西安交通大学第二附属医院199901/200605病理确诊手术患者.SCC45例，年龄45～95(平均68.8)岁，男27例，女18例.Bowen病19例，年龄45～87(平均65.2)岁，男12例，女7例.正常人皮肤10例对照，年龄46～78（平均62.5）岁，男5例，女5例作鼠抗人MMP9mAb（MAB0245）和CD34mAb（(MAB0034)，免疫组化SP试剂盒(KIT9710)及DAB试剂盒均购自福州迈新生物技术有限公司.

1.2方法所有组织均经40g/L甲醛液固定，常规石蜡包埋切片，连续切片5张，厚约4μm.采用SP法，免疫组化染色程序按试剂盒说明书进行.阳性对照采用自身对照,用PBS代替一抗和二抗进行阴性对照.MMP9和CD34均采用高温高压抗原修复.MMP9结果判定：在不知任何背景资料的情形下,采用双盲法进行判定,以肿瘤细胞膜和/或细胞质出现淡棕黄色颗粒为阳性，并按着色强弱分级：无色为0，浅黄色为1，深黄色为2，棕黄色为3；着色范围以在10×40高倍镜下随机选区5个视野（每个视野记数100个细胞）计数阳性细胞所占的百分数均值：＜25%为1,25%~49%为2，50%为3.上述两项相加为MMP9的表达强度积分：＜2为阴性，＜3为弱阳性（+），3~4为阳性（），＞4为强阳性（）.MVD计数参照文献［3-4］方法进行微血管计数，先在低倍镜（×100）下观察确定血管密度最高处，在（×200）视野下选择3个高血管密度区，计算单位视野（×200）平均血管数.单个内皮细胞或内皮细胞簇，均作为一个血管计数，而直径大于约8个红细胞的血管，有较厚肌层的血管以及硬化区的血管不在计数范围内.

统计学处理:采用SPSS10.0统计软件包进行处理,根据资料类型组间比较分别采用方差分析和χ2检验，P<0.05为有统计学意义.

2结果

2.1MMP9MMP9阳性改变为细胞质或细胞膜呈棕黄色，偶尔可见细胞核着色，阳性颗粒多呈团块状.正常人皮肤组织中MMP9呈弱阳性表达，主要表达于颗粒层和棘细胞层，真皮层中纤维样细胞、单一核细胞等见阳性染色.BD组织中表皮全层均有MMP9均匀弥漫表达.SCC中MMP9在癌巢组织弥漫分布，以肿瘤周边表达强烈（图1）MMP9表达在正常皮肤组、Bowen病组、SCC组依次增高（表1）.MMP9在SCC组中高于Bowen病组织（χ2=6.667,P<0.05），Bowen病组中MMP9高于正常皮肤组（P=0.028，P<0.05）.在SCC组中MMP9的表达与患者的年龄、性别、肿瘤组织的病理分级均无关（P＞0.05）.

表1MMP9在正常皮肤组、Bowen病组和SCC表达(略)

2.2MVD计数CD34标记的微血管呈点状分布，血管内皮细胞膜被染成褐色.在SCC组织中微血管形态不规则，部分血管呈现发芽状，血管分布不均匀，在SCC的边缘区域最为密集，呈簇状(图2).Bowen病组织中微血管形态较规则，但分布不均，血管簇偶见.正常皮肤组织内的微血管形态规则，分布均匀.Bowen病组中和SCC组中MVD明显升高（表3）.

图1SCC组织MMP9表达SP×400(略)

表2SCC组织MMP9表达与患者年龄、性别及鳞癌分期的关系(略)

图2SCC组织MVD计数SP×100(略)

表3CD34和MVD在Bowen病和SCC中表达(略)

aP<0.05vs正常皮肤.

3讨论

本研究结果显示,MMP9在SCC组中高于Bowen病组织（P<0.05），Bowen病组中MMP9高于正常皮肤组（P<0.05）.Bowen病MMP9在增生表皮细胞质或细胞核表达；在SCC组织中MMP9在肿瘤细胞，增生上皮细胞和间质细胞均有阳性表达，在表达的强度、阳性细胞的种类、数量上均高于Bowen病组，提示MMP9高表达可能是SCC转移、侵袭能力的分子基础.同时观察到仅有部分有肿瘤细胞能表达MMP9，且表达MMP9的肿瘤细胞多位于癌巢的外周部分和毛细血管、淋巴管管腔周围，提示MMP9表达的肿瘤细胞可能具有更强的侵袭能力.实体肿瘤的新生血管提供了更多与体循环连接的通路，这使肿瘤细胞更容易从原发灶向远隔部位转移.肿瘤组织中微血管密度越大，肿瘤细胞进入血循环及淋巴循环的机会越多，淋巴结及邻近脏器转移的机会也增大.在许多肿瘤中都发现：微血管密度与肿瘤侵袭性与肿瘤转移的发生率相关［1,5-6］.近来研究表明，MMP9不仅是降解基底膜和ECM的关键酶，而且在肿瘤间质血管生成中起重要作用［1，5］.Wang等［7］人的研究表明,存在于细胞外基质的VEGF能够通过存在于血管平滑肌细胞上的VEGFR1受体调节MMPs的表达.而MMPs又能降解细胞外基质释放更多的VEGF,这便建立了一个正反馈调节环路来促进新生血管的形成.Naglich等［8］研究发现MMP1,MMP2,MMP9诱发和促进血管生成，TIMP1,TIMP2,TIMP3,TIMP4抑制新血管生成.

本实验显示，在SCC组织中微血管形态不规则，血管分布不均匀，在SCC的边缘区域最为密集，呈簇状.Bowen病组织中微血管形态较规则，但分布不均.正常皮肤组织内的微血管形态规则，分布均匀.SCC组中MVD高于Bowen病组织（P<0.05），Bowen病组中MVD高于正常皮肤组（P<0.05），提示细胞在发生恶性转化之前已有血管生成增多，这很可能是SCC血管生成的启动阶段.我们发现在SCC组、Bowen病和正常皮肤组中MMP9表达高者MVD表达亦高，且MMP9的高表达的部位与MVD高密度区具有一致性，均位于癌巢边缘地区，提示：肿瘤的浸润生长与新生血管生成是同步进行的，MMP9的表达与肿瘤血管形成有关.本研究结果表明，SCC的发生和侵袭转移与肿瘤细胞的分化程度及新生血管的密度密切相关，MMP9可能是SCC的重要促血管生成因子之一.阻断MMP9的表达，抑制MMP9的活化可能对抑制SCC转移具有重要意义.

【参考文献】

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［3］FangJ,ShingY,WienderschainD,etal.Matrixmetalloproteinase2isrequiredfortheswichtotheangiogenicphenotypeinatumormodel［J］.ProcNatlAcadSciUSA,2000,97(21):3884-3889.

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