揭秘化妆品安全性评价技术(四)

摘要：眼睛是最容易接触化妆品及其成分的器官之一，眼刺激性评价是化妆品原料及产品安全性评价的主要内容，传统眼部刺激试验采用实验动物进行，不仅外推到人具有一定的风险，而且造成动物极大的痛苦。近年来，多种替代动物试验的体外方法被开发和应用。

在某些条件下，眼睛可能成为化妆品及其成分作用的靶器官或吸收途径，因而外源物质可能造成眼部的健康危害，这些可能发生的毒性作用包括：眼及外周组织的局部刺激、损伤和炎症反应，过敏反应，眼深部的组织损伤，临床表现为眼部疼痛、刺痛、灼热、眼睑眨动、泪液增多，严重者引起不同程度的功能性损失，如角膜浑浊、水肿、甚至视力下降。正常情况下，眼睛很少直接接触外源物质。但在化妆品使用过程中，通常由于意外使化妆品以稀释的形式进入眼睛（例如香波），产生刺激作用。眼刺激性是指眼睛前表面直接接触受试物后引起的眼及其周围粘膜可逆性炎性变化。眼腐蚀性是指眼睛前表面直接接触受试物后引起的眼及其周围粘膜不可逆性组织损伤。

检测化学物的刺激性和腐蚀性的传统实验是由Draize等提出的兔眼实验，目前仍是测定急性眼毒性的国际标准。近年来，在动物福利的压力下，一些优化的试验方法被提出，并陆续被验证和认可。除了经验证认可的替代方法外（BCOP试验、ICE试验、IRE试验），大多数化妆品公司将一些所谓“有效（valid）”替代方法用于化妆品成品筛选。有效替代方法被定义为：还没有通过完整验证程序的技术，但存在足够多的科学数据证明其相关性和可靠性。这些方法包括HET-CAM测试、RBC试验及NRU试验。这些方法目前可作为危险识别的筛选工具，用于非风险评估过程。

一、体内眼刺激的发生机制

体内眼刺激的发生机制表明，实验兔暴露受试物后最初几个小时（一般3小时）内，角膜的损伤程度可以预测眼睛损伤的持续时间和最终损伤程度。一般来说，轻度刺激物只影响表层角膜上皮，轻度和中度刺激物主要影响上皮和表层基质，严重刺激物能穿透更深的基质发挥作用，甚至可能是基质全部。而且损伤的可逆性和最初的损伤程度相关。

角膜损伤程度（细胞损伤）和大体观察两者之间的相关关系，对于开发和验证预测眼刺激性的体外/离体检测方法提供了机理性基础。在所有可能影响角膜损伤的动力学因素中，受试物的自身细胞毒性潜力排在第一位。那些可溶解细胞膜或者是导致蛋白质凝集的物质可立即产生细胞毒性，如表面活化剂和一些有机溶剂是这类物质的代表。那些作用于细胞能量代谢的物质也可快速产生作用，但可能没有第一类物质迅速。化学物质还可以通过对大分子的烷化或者其他影响而产生作用，这类物质的作用可能表现为一种迟发性的细胞毒性（如迟发性坏死或者凋亡）。

体内眼刺激实验中受试物局部接触角膜和结膜，而实际情况下暴露的持续时间并不确定，可能从几分钟到几小时不等。角膜细胞层的暴露深度取决于受试物渗透和锚定于表层的速度和能力。这样就很好理解产生明显细胞毒性所需的时间和细胞接触受试物后产生“损伤”所需的时间并不一致，而后者可能最终导致细胞死亡。那些快速损伤细胞的物质可能更容易对眼细胞产生毒性作用。

二、动物实验及优化方法

动物试验是受试物直接接触动物结膜囊，随后通过肉眼仔细检查角膜，虹膜和结膜的变化，并量化评分，从而对生理反应做出分类。目前在不同的法规中有多种不同的评分系统，评价范围有最大单次组织计分和全部三种组织平均加权总分计分几种。对于化妆品的安全评估，加权总分、最大平均分(MAS)和改良最大平均分（MMAS，不包括接触受试物后1小时的结果）均在使用。

这些年来，为了减轻动物遭受的痛苦和使受损组织更快恢复，已经提出一些优化意见，例如低眼容量实验（LVET）。目前，减少和优化的方法已经包括在试验策略中，作为动物试验的补充，而体内兔眼试验仅需要在最后一步进行，也就是说当全部其他序列试验已经得出阴性评价结果，需要对轻度到中度的刺激性混合物进行评价时才考虑性体内试验。

三、体外试验方法

1991至1997年间在欧盟机构主导下，共进行了6项眼刺激试验的评价研究，对9项体外替代方法进行了评估。当时的结论认为没有一项研究可以完全替代Draize实验，但其中的一些实验作为眼刺激物筛选的方法或组合试验的一部分可用于眼刺激试验的替代方法。后来经过持续改进，部分替代方法通过了ECVAM、ICCVAM等验证机构的验证，2009年，BCOP、ICE和IRE方法被OECD认可用于替代眼刺激试验。

1 牛角膜浑浊和渗透性实验（Bovine Corneal Opacity and Permeability，BCOP）使用屠宰场获得的标本，将新鲜分离的角膜水平固定于支持架，然后放置于特殊改进的透光容器里。恒温条件下，封闭角膜将测试容器分为上下2个隔室，受试物添加于上隔室中，通过测量下室培养液的光密度（OD）评估角膜的渗透性。测出的透光值和渗透值可用来进行体外分值计算。根据这一评分系统可对受试物进行分类。BCOP可用于化妆品原料及成品的安全评估，也可用于日用和工业用清洁产品、盥洗产品、杀虫剂等相关化学品和配方。BCOP实验非常适合用于测试不同物理性状和溶解度范围较大的受试物，适用于鉴定中度、重度和极重度眼刺激性物质，但对区分轻度到极轻度的水平的刺激物似乎不太敏感，后者更适合用上皮样组织结构或者细胞毒性方法进行检测。欧盟ECVAM和美国ICCVAM 于2007年通过对该方法的验证，2009年成为OECD正式试验指南（TG437）。

2 离体兔眼实验（isolated rabbit eye test，IRE），其原理是眼球接触刺激性物后，检测角膜透光值和角膜增厚（角膜肿胀）评价受试物的眼刺激性。从人道处死的实验兔分离完整眼球，固定和直立维持于超渗容器中，滴入生理盐水使角膜保持湿润。试验时，将受试样品直接与眼球接触。暴露时间不定，例如鉴定严重刺激物接触10秒，区分损伤程度较轻的受试物可接触1分钟或更长。去除受试物后，将眼球重新放入容器中，检查角膜透光值和角膜厚度。30分钟和1、2、3、4小时后进一步评估。染毒30分钟和4小时分别检查荧光素渗透性。记录角膜透光值和荧光素渗透性。根据获得的试验结果，通过不同观察指标的组合分析可对受试物的总体损伤做出评估。通常导致角膜水肿超过15%的化学物可认为具有严重眼刺激性。IRE实验适合检测大多数类型的受试物，特别是用来筛选严重刺激性的物质（R41）。IRE实验主要用来预测角膜损伤，它不能提供受试物对结膜的作用或角膜损伤后的恢复。因此不能绝对认为IRE实验中未观察损伤代表在体内也无作用。

3 离体鸡眼实验（Isolated Chicken Eye，ICE），ICE是一种利用离体鸡球短期培养进行眼刺激检测的体外方法，眼损伤通过角膜水肿、通透性和荧光素渗透进行评价。可用于评价腐蚀物和严重眼刺激物，或作为组合试验的一部分用于特定化学物质的法规分类的标识。其原理和具体操作过程类似于IRE。角膜水肿、透光值和荧光素滞留的数值作为毒理学终点。平均最大分值用于对无刺激到严重刺激物进行分类，计算ICE刺激指数，其范围从2到200。ICE实验可作为替代兔眼刺激试验的有效的常规检测方法。法国和德国均认可ICE实验用于鉴别严重刺激性物质。荷兰认可其作为鉴别“眼严重刺激物（R41）”的筛选方法，但不能作为区分刺激物和非刺激物的确认试验。CEET实验可用于化妆品和日用品企业实验室。欧盟ECVAM和美国ICCVAM 均于2007年通过对该方法的验证和认可。2008年列为OECD新的试验指南草案，2002年EU认可用于严重眼刺激物(R41)的鉴定和标识方法，2008年美国认可其作为组合试验策略中检测眼腐蚀物和严重眼刺激物的筛选方法。2009年OECD认可为试验指南438。

四、未验证的方法

1 鸡胚绒毛膜尿囊膜试验（Hen`s egg test on the chorio-allantoic membrane, HET-CAM）利用鸡胚绒毛膜尿囊膜结构与人结膜相似的特点，可用于眼刺激物或腐蚀物有鉴定。HET-CAM试验系统主要测定3种反应，即出血、血管溶解和凝血（有时充血也可作为观察指标）。受试物直接接触CAM膜，于5分钟内评价上述三种指标的发生情况。使用最广泛的方法是反应时间法，测定3种反应终点每一种出现的时间。另一种方法是刺激阈值法，测定第一次观察到出现上述毒性终点的受试物浓度。第三种方法可用于不透明难溶解和固体受试物的检测，即将CAM暴露于受试物一个固定时间（如30秒或者5分钟），小心冲洗除去受试样品后检查上述终点。大多数验证评估结论认为HET-CAM实验和Draize实验在评估原材料和化妆品方面具有相关性。体外实验和体内实验在轻度和非刺激性受试物、表面活性剂和以表面活性剂为基础的配方等物质的测试中显示较好相关性。但是，HET-CAM试验没有覆盖Draize的最大平均分值(MAS)的全部范围，对于固体、不溶性或粘稠物质的测试在实验结果的重复性方面较差，色素和染料可通过对CAM染色而产生干扰。HET-CAM实验可作为眼刺激性的筛选方法，用于配方/原料的安全评价中，确定可能的非刺激性或者轻度刺激物，有效的减少了动物试验。也可用于为管理目的进行的风险评估中和用于物质的标识和分类。HET-CAM实验已被法国、德国、荷兰和英国的管理部门认可，用于严重刺激物的分类。

2 绒毛膜尿囊膜血管试验（Chorioallantoic membrane vascular assay，CAMVA）方法通过观察受试物对血管的作用评价潜在的眼刺激性，取10天龄鸡胚，受试物直接接触CAM的小片区域，暴露30分钟后观察CAM血管变化，例如出血或充血（毛细血管扩张）、血管消失（鬼影血管），使50%的受精卵出现这些损伤的受试物浓度被认为是毒性终点。CAMVA试验需要测定10个供试鸡胚出现50%阳性反应所达到的剂量。水溶性和脂溶性物质都可用于检测。COLIPA和美国CTFA等在内的多个机构组织的验证评估研究结果表明，CAMVA方法和兔眼刺激实验的最大平均分值(MAS)值有很好的相关性，可正确将受试物分类为刺激物和非刺激物。COLIPA的研究结论表明CAMVA更适合检测水醇类物质。总体上讲，适合作为化妆品和个人护理用品配方、醇类物质和表面活性剂的刺激程度的筛选方法。最适合用于评价轻度到中度范围的刺激性物质，但不能用于严重刺激性物质的分类。

3 绒毛膜尿囊膜苔盼蓝染色试验（chicken chorioallantoic membrane - trypan blue staining，CAM-TB）是经过改进的HET-CAM方法。CAM-TB试验克服了HET-CAM实验缺乏客观性和难量化的缺点，通过测定CAM吸收台盼蓝的量来检测受试物损伤作用。结果表明该方法比HET-CAM实验方法变异性低，而且和最大平均分值(MAS)有很好的相关性。局限性与HET-CAM类似，有色物质可能干扰终点的测定。

4 重组人角膜组织模型（Human corneal epithelium models）

EpiOcular模型由美国MatTek公司生产，由来源于正常人的表皮角质细胞生长于特殊制备的嵌入式细胞培养板中以无血清培养基制备而成，细胞分化形成的多层结构与角膜上皮相似。EpiOcular试验与多项细胞毒性和刺激试验联合使用，主要是MTT检测，也包括IL-1a、PGE2、LDH和钠荧光素渗透性检测。通过MTT试验得出ET50的值（使组织活性降低50%的有效暴露时间）并与动物体内试验数据比较，可用于检测中度到极轻度范围内的眼刺激物。通过非常短的ET50的值，该模型也可用于区分高中度和严重刺激物。目前该方法已在化妆品、个人护理、日化和化工企业的研究实验室和企业使用，用于确定受试物的毒性限量（如测定轻微作用水平剂量），或用于（轻到中度眼刺激性）产品配方的临床前安全性试验，以及用于配方优化、表面活性剂及其配方的安全评估等。

SkinEthicTM HCE模型是由法国SkinEthic实验室开发，是将永生化人类角膜上皮细胞（HCT细胞系）接种于聚碳酸酯人造膜上，用已知化学成份的培养基，采用气-液界面培养，形成由多层上皮细胞组成的与人眼角膜粘膜类似的重建组织。可作为检测的终点包括：MTT试验或LDH释放测定组织活性、组织学观察、细胞因子释放定量（例如，IL-1a、IL-6、IL-8、PGE2）和基因表达。实验室数据获得了Colipa眼刺激性项目组和ECVAM专家组的认可，并且正在进行审核以进入ECVAM的验证过程。

5 中性红摄取（NRU）试验

细胞毒性试验也可用于检测眼刺激性，检测受试物抑制活性细胞摄取中性红染料的能力。常用的NRU试验包括正常人表皮角质形成细胞（NHEK），balb/c3T3小鼠成纤维细胞和兔角膜IRC细胞系。这些方法通常在许多化妆品和制药公司的实验室采用，作为组合试验的组成部分，或作为筛选眼刺激物序列试验的辅助方法，以及作为EU危险品R41分类的附加试验，通常NRU试验与体外器官型试验联合使用。NHEK细胞的NRU试验参与了分别由CTFA和SDA组织的2项研究。Balb/c 3T3细胞NRU试验参与了国际性的EC/HO研究、COLIPA研究、BMFT/BGA研究和CTFA的评估。SIRC细胞的NRU试验参与了OPAL的评估和日本MHW-JCIA联合研究。NRU试验对于检测表面活性剂与体内Draize MAS数据有很好的相关性。对于轻度眼刺激物评价和分类，NRU试验是一项特别有用的方法，但其单独作为区分中度和重度眼刺激物质的方法有其局限性。

6 红细胞溶血试验（Red blood cell haemolysis test，RBC）

该试验原理是根据化学物质能损伤细胞膜的原理设计的，通过测量标准条件下与受试物孵育的新鲜分离的红细胞中血红蛋白的渗漏量的吸光值来评估试验结果。氧合血红蛋白（oxyHb）变性（即蛋白结构改变）作为第二毒性终点。哺乳动物红细胞容易获得，因此RBC试验可减少眼刺激试验的动物使用。试验分2个步骤，在浓度确定试验中，60分钟内将红细胞暴露于浓度逐渐增高的受试物中，通过测定541nm处减少的吸光值可得出红细胞溶解和oxyHb的变性结果。此步骤的目的是为确定使红细胞溶解发生的受试物浓度范围。正式试验通过与参照样本相比得出全部测定结果，对照样品应使全部红细胞发生溶解（将其设定为100%溶血）。RBC试验作为序列组合试验的一部分用于常规筛选试验。主要适用于表面活性剂的检测，受试物可为水溶性和疏水性物质。如与其他替代方法联合使用，可提高其对眼刺激性的总体评估。

目前认为虽然没有单独体外试验可以覆盖Draize兔试验的损伤和炎症的标准范围，而且替代方法均有其局限性，但采用自上而下的方法，或自下而上的方法，通过一系列替代方法的组合，可实现完全覆盖Draize兔试验所显示的刺激性范围。如从反应最轻微眼刺激性的方法（细胞法和鸡胚法），到筛查中等刺激试验的方法（人工角膜），到检测严重刺激性和腐蚀性的方法（牛角膜混浊试验）。