Beclin1在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

【摘要】 目的 检测人非小细胞肺癌标本中自噬相关基因beclin1的表达并讨论其意义及与细胞病理类型和临床分期的关系。 方法 采用免疫荧光染色、rt?pcr和western blot法检测54例非小细胞肺癌的肺癌组织、癌旁组织、正常肺组织beclin1蛋白、mrna表达。结果 免疫荧光染色显示beclin在肺癌组织中表达较低，表达率为8.3%，显著低于癌旁和正常组织(p=0.00)。beclin1 mrna在肺癌、癌旁及正常组织中的相对表达量为1.302±0.074、1.691±0.100、1.673±0.081(f=6.6, p=0.002)，western blot检测beclin1蛋白在肺癌、癌旁、正常组织中的相对表达量分别为3.489±0.293、5.306±0.459、6.329±0.580（f＝9.73，p<0.01）。beclin1蛋白和mrna表达与肺癌病理组织类型和临床分期无明显关系。结论 beclin1蛋白和mrna表达在肺癌组织中明显低于癌旁和正常组织，表达量的差异有统计学意义，在癌旁和正常肺组织中表达接近。

【关键词】 自噬 beclin1 非小细胞肺癌

肺癌是发病率较高的恶性肿瘤，在其发生和发展过程中，抑癌基因的失活、细胞内异常物质和内环境的改变、受损细胞器清除障碍、癌细胞凋亡受阻等因素都可能起到重要作用，这些过程都有自噬参与。beclin1是一种与自噬密切相关的抑癌基因，编码自噬相关蛋白。beclin1在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌中表达均有缺失[1]，在蛋白和mrna表达水平研究自噬在肺癌中的表达目前鲜见报道。本研究检验了自噬相关基因beclin1在肺癌、癌旁组织、正常肺组织临床标本中的表达情况，并探讨其与肺癌的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象和标本采集

选择2006年4月～2006年10月手术切除的非小细胞肺癌标本54例，所有病例经病理学确诊,术前均未接受放、化疗。每例标本取肺癌组织及相应的近癌旁组织(距肿瘤边缘1～3cm)、正常组织(距肿瘤边缘> 5cm)各一个样本。54例患者中男39例,女15例。年龄37～75岁,平均（56.3±8.1）岁。肿瘤组织病理类型均为非小细胞肺癌，其中：腺癌32例，鳞癌17例，大细胞癌3例，腺鳞癌2例。依据1997 年uicc tnm 分期: ⅰ期11 例, ⅱ期27例, ⅲa期16例。所取组织标本手术切除后立即用生理盐水洗净血污后装ep管置液氮罐保存备用。

1．2 主要试剂

beclin1一抗购于美国santa cruse公司，逆转录pcr试剂盒(takara公司)和 rna试剂盒（包括了taq酶）购置北京赛百盛基因技术有限公司,beclin1引物由上海生工生物技术有限公司合成。

1.3 免疫荧光染色

取各组肺癌组织，冰冻切片（厚度0.1mm），1/2丙酮+1/2酒精固定5min，0.3％ triton破膜，加入beclin1一抗4℃过夜（1∶200），以pbs 代替一抗作为空白对照，阴性抗体作为阴性对照。pbs漂洗后加兔抗羊igg fict荧光二抗(1∶100)，避光37℃ 0.5h。激光共聚焦显微镜下波长为353.6nm观察拍照。

1.4 rt－pcr方法

rt?pcr方法：每份冻存标本取1mm3剪碎研磨,加入1ml trizol溶液裂解,按trizol试剂盒说明书采用一步法提取总rna,以dna/rna测定仪测定rna的纯度和浓度。按逆转录合成试剂盒说明合成cdna，待用。gapdh作为内参照，目的片段为452bp,引物序列：5′?accacagtccatgccatcac?3′(上游), 5′?tccaccaccctgttgctgta?3′（下游）。beclin 1: 5′?atcctggaccgtgtcaccatccagg?3′ (上游)， 5′?gttgagctgagtgtccagctgg?3′ （下游）, 363bp；map?lc3: 5′?gaagatgtccgacttattcgagag?3′(上游)5′?actctcatacacctctgagattgg?3′（下游）, 352bp。pcr条件：94℃ 1min, 55℃ 1.5min， 72 ℃ 0.5min，共30个循环。结果用quanlityone分析，以阳性条带与gapdh光密度比值作为阳性条带的相对表达值，spss11.5统计学分析。

1.5 western blot检测

ripa buffer 200μl裂解细胞, 考马斯亮蓝法蛋白定量, 常规电泳、 转印和封闭后, 加入beclin1(1∶100)4℃孵育过夜; 抗人碱性磷酸酶标记二抗(1∶3000, 北京中杉金桥生物技术有限公司), 室温孵育2h, 碱性磷酸酶染色5min, 胶片曝光显影， 结果用quanlityone分析， β?actin为内对照， 以阳性条带与内对照光密度比值作为阳性条带的相对表达值。

1.6 统计学方法

采用spss11.5作统计学分析。

2 结果

2.1 免疫荧光结果

免疫荧光染色显示正常组织和癌旁组织均有beclin1表达（表达率100％），见图1a～c，beclin1在49例肺癌标本中不表达（90.7%）。不表达的癌细胞呈空泡状未染色状态，见图1d～f。beclin1在肺癌和非癌组织中的表达差异有统计学意义（χ2=60.9, p=0.00）。

2.2 rtpcr检测结果

beclin1 mrna表达出现在所有组织中。gapdh mrna半定量后beclin1 mrna在肺癌、癌旁、正常组织的相对表达量分别为1.302±0.074、1.691±0.100、1.673±0.081(f=6.6, p=0.002)。beclin1在肺癌组织和其他组织中表达量差异有统计学意义, 在癌旁组织和正常组织中的相对表达量差异无统计学意义， beclin1 mrna在癌旁组织和正常组织中的表达量均强于肺癌组织，见图2。

图1 beclin1在肺癌组织未表达（箭头所示）呈空泡状,正常组织表达良好

图2 beclin1 mrna在正常组织、癌旁组织、肺癌组织的表达

2．3 western blot检测结果

肺癌组织中的beclin1蛋白低表达（肺癌组织：3.489±1.760；癌旁组织：5.306±2.755；正常组织：6.329±3.483），癌旁或正常组织中高表达（f＝9.73，p<0.001），相对表达量差异有统计学意义（p＝0.000）（图3）。

图3 beclin1蛋白在正常组织、癌旁组织、肺癌组织的表达

2.4 beclin1在不同病理类型和临床分期中表达

在本研究中，nsclc的不同细胞病理类型以及临床分期之间，beclin1的mrna表达以及蛋白表达差异无统计学意义，见表1。

3 讨论

beclin1位于人类染色体17q21上,大约有150kb，被认为是一种双等位抑癌基因（haploinsufficient tumor suppressor），其杂合性缺失是细胞发生恶性转化的原因之一[2]。据报道75%的人类卵巢癌[3,4]、50%乳腺癌[5]和40%前列腺癌[6]细胞存在beclin1单等位基因缺失突变,其表达量不同程度下降[7]。恶性肿瘤中beclin1的双等位基因突变则较为罕见。关于肺癌的beclin1基因突变少见报道。本研究发现beclin1蛋白在正常肺组织中表达的相对量显著高于肺癌样本，和癌旁组织差异无统计学意义；肺癌组织的免疫组化染色普遍呈阴性，照片显示和正常组织形成鲜明对比的空泡状无染色区； rtpcr 结果也提示肺癌组织beclin1基因转录的减少。同时我们也观察到，beclin1的表达情况与肺癌的病理组织类型和临床分期没有明显的相关性，尚难对其与癌细胞生物学特性的关联作出推断。

beclin1是哺乳动物参与自噬的特异性基因，主要通过调节自噬水平而对肿瘤的发生、发展起着重要作用[2]。自噬现象是一种高度保守的细胞行为，几乎存在于所有的物种，构成了从简单的单细胞生物、植物到哺乳动物细胞中广泛存在着的降解/再循环系统的重要组成部分[7]，并且是完整细胞器和大分子蛋白降解的主要途径[8]。自噬的失调和肿瘤的发生、发展、转归关系密切[9，10]。beclin1通过调节自噬水平参与细胞内大分子物质的循环及再利用、受损细胞器的清除，并维护细胞内环境稳态[11]，自噬体的形成与atg(autophagy?related gene)系列基因有关，beclin1是酵母atg6的同系物,也是哺乳动物参与自噬的特异性基因，beclin1基因主要与ⅲ型pi3k(phosphatidylinositol 3?kinase)形成复合体来调节其他的atg蛋白在自噬前体结构中定位，来调节自噬活性[12]。已经证实上调beclin1在哺乳动物细胞中的表达能够刺激自噬的发生[13]。

和传统的抑癌基因不同， beclin1基因是一类新的抑癌基因， 只有在双等位染色体都表达时才能够发挥抑癌作用。 beclin1等位基因敲除的小鼠发生自发性恶性变（包括乳腺肿瘤、肺癌、肝癌等）几率增加，且易受hbv诱导的前恶变性损伤。beclin1蛋白在人类乳腺癌中表达较正常乳腺细胞低，将表1 不同病理类型和临床分期肺癌组织的beclin1 mrna和蛋白表达beclin1转染人乳腺癌细胞株mcf7 后抑制mcf7细胞在体外增殖,并降低mcf7细胞的成瘤性[13],这些发现都提示了beclin1的抑制肿瘤作用。beclin1基因还和一些肿瘤相关信号传导通道关系密切， 例如： pten通道[14]和 rb信号传导通道[15，16]都与beclin1不同程度相关。beclin1也能够协同其他药物的抗肿瘤作用，上调beclin1的表达能够增强顺铂诱导的胃癌细胞系mkn28凋亡，抑制beclin1则削弱了顺铂的细胞毒作用[17]。

关于beclin1对于肺癌的早期诊断和预防的价值，调控beclin1的表达对于不同时期肺癌细胞发展的影响，以及协同其它抗肿瘤手段对于肺癌的治疗效果，目前仍然缺少相关资料。进一步的研究将对阐明肺癌的发生、发展机制并为最终开发新的治疗手段提供理论依据。

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