枯草芽胞杆菌ACCC―10619产芽胞条件的研究

摘 要 通过单因素发酵试验和正交试验，确定了枯草芽胞杆菌ACCC10619最佳培养基配方和发酵条件.结果表明最佳质量分数组合为：麸皮3.0%，葡萄糖3.0%，硫酸铵0.5%，硫酸锰0.05%，发酵温度33 ℃，初始pH为70，发酵周期36 h，静置时间12 h.经100 L发酵罐液体扩大培养，芽胞产量达85×1013个/L.为枯草芽胞杆菌微生态制剂生产应用提供参考.

关键词 枯草芽胞杆菌；发酵条件；芽胞

中图分类号 Q939.9 文献标识码 A 文章编号 10002537（2013）03007005

Study on Conditions of Spore Fermentation for Bacillus Subtilis ACCC10619

ZHOU Yong1，2， WANG Zheng1*， LIN Yuanshan1，2

（1.College of Bioscience and Biotechnology， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China；

2.Changsha Shuidisha Biological Technology Co.， Ltd， Changsha 410125， China）

Abstract The optimal formula of culture media and fermentation conditions for Bacillus subtilis ACCC10619 were determined by methods of single factor tests and orthogonal experiments. The results showed that the optimal conditions were as follows： wheat bran 3.0%， glucose 3.0%， ammonium sulfate 05%， manganese sulfate 005%， initial pH 7.0， cultured at 33 ℃ for 36 h with static time 12 h. The output amounts of spore reached 85×1013cfu/L under volume of 100 L expanding fermentation. It could provide reference for production applications of Bacillus subtilis microbial ecological agents.

Key words Bacillus subtilis； fermentation； spore

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当今全世界化学农药年产量超过2 Mt，有500多种在农业中使用，造成环境严重污染，生态遭到破坏，害虫抗药性增强，人畜常中毒伤亡[1].而生物防治制剂对人畜、植物无伤害，安全可靠，不污染环境，能有效地保持生态平衡. 枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）是一种好氧产芽胞的革兰阳性细菌，其生理特征丰富多样，分布广泛，极易分离培养.该菌能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力.对许多植物病原生物具有拮抗作用的非病原微生物，小麦白粉病、黄瓜枯萎病[2]、胡萝卜立枯病[3]、烟草黑胫病[4]等多种植物病害有明显的防治效果；已在农业生物防治、畜牧、水产养殖、医药及分子生物学研究等方面广泛应用[5]，显示了一定的社会效益和生态效益.枯草芽胞杆菌最突出的特征是生长快、营养简单、能产生耐热抗逆的芽胞，这也有利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中的存活、定殖与繁殖[6].本研究通过优化发酵培养基配方及发酵条件，提高发酵液中芽胞含量，降低生产成本，为枯草芽胞杆菌微生态制剂生产提供技术参考.

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试菌 枯草芽胞杆菌ACCC10619，购自中国农业科学院菌种保藏中心.

1.1.2 培养基 固体平板培养基：麸皮（过178 μm筛）3.0 g，琼脂2.0 g，自来水100 mL，121 ℃灭菌25 min.

液体发酵培养基（基本培养基）：麸皮（过178 μm筛）3.0 g，自来水100 mL，121 ℃灭菌25 min.

湖南师范大学自然科学学报 第36卷第3期

周 勇等：枯草芽胞杆菌ACCC10619产芽胞条件的研究1.2 实验设计

1.2.1 摇瓶发酵试验 在250 mL的三角瓶中加入质量分数为3.0%的麸皮为基本培养基，添加不同种类和浓度的碳源、氮源、无机盐后，加入自来水定容至100 mL；并在不同单因素条件（温度、pH、发酵时间、静止时间）下，每个水平3次重复，灭菌接种后置于180 r/min摇床振荡培养48 h后取样测芽胞数量，根据芽胞数量高低确定最佳培养基和发酵条件[7].

1.2.2 100 L发酵罐发酵试验 在摇瓶发酵正交试验基础上，进一步进行100 L液体发酵扩大培养.

1.3 生物量的测定

芽胞计数方法，参照GB20287―2006《农用微生物菌剂》.

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel、DPS软件进行数据处理和方差分析.

2 结果与分析

2.1 单因素摇瓶发酵优化试验

2.1.1 麸皮质量分数对枯草芽胞杆菌产芽胞的影响 依次选择液体发酵培养基的麸皮质量分数（过178 μm筛）3.0%～8.0%，在180 r/min 、35 ℃摇床发酵48 h，测定发酵液中的芽胞数量（图1）.当麸皮质量分数为60%时枯草芽胞杆菌产芽胞数最多，达261×1013个/L，但麸皮质量分数为3.0%～6.0%时无显著差异（P