时间：2022-07-31 10:37:53
[摘要] 采用HPLC-UV测定枳实和栀子大黄汤灌胃后大鼠血浆中总柚皮素和总橙皮素浓度，血浆样品通过液液萃取法进行提取，通过酸水解的方式将柚皮素?橙皮素缀合物转化为游离柚皮素?橙皮素?Phecda C18色谱柱 （4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相0.1%磷酸-甲醇，梯度洗脱，流速1.0 mL・min-1?采用DAS 2.0 数据处理软件及SPSS 16.0 统计软件分别进行药动学参数计算及比较?枳实组（ZS）和栀子大黄汤组（ZZDHD）中总柚皮素?总橙皮素的药动学参数存在显著性差异，ZS组中总柚皮素的Cmax，AUC0-t分别比ZZDHD组的高出73.5%，65.9%，ZS组中总橙皮素的Cmax，AUC0-t分别比ZZDHD组的高出63.5%，119.1%?说明栀子大黄汤中其余成分对枳实中总柚皮素?总橙皮素的药动学特征具有显著影响，经配伍后其Cmax，AUC0-t显著降低?该方法简便准确?灵敏度高?特异性好，可以应用于血浆中总柚皮素和总橙皮素含量测定?
[关键词] 栀子大黄汤；配伍；HPLC-UV；总柚皮素；总橙皮素；药动学特征
[收稿日期] 2014-02-24
[基金项目] 国家自然科学基金项目（81274063）
[通信作者] 冯芳，教授，研究方向为现代药物质量研究及评价，Tel：（025）83271301，E-mail：
[作者简介] 刘小雨，硕士研究生，E-mail：
目前临床所见酒精性肝病有逐年增多的趋势，居肝硬化病因的第2位?栀子大黄汤对酒精诱导的急性肝损伤具有保护作用，保肝作用的主要药效物质群为环烯醚萜类?黄酮类?蒽醌类[1]?枳实中异柚皮苷?柚皮苷?橙皮苷?新橙皮苷具有抗氧化?抗炎?抑制肝病毒?抗氧化?抗纤维化?抗肿瘤与抑制P450代谢酶活性等作用[2-7]；苷元柚皮素?橙皮素也具有类似的药理活性?这些活性物质对酒精性肝病的形成具有抑制作用?目前国内外关于柚皮素?橙皮素的药动学研究大多测定游离形式，但柚皮素?橙皮素的二相代谢物具有活性且占较大比例?不易获得对照品进行直接测定[8-9]，本研究采用酸水解的方法获得血浆中总柚皮素和总橙皮素的浓度，并应用于药代动力学研究，进一步发掘配伍规律，为其应用于酒精性肝病的临床治疗提供参考和依据?
1 材料
1.1 药材与试剂
柚皮素（批号13041107） ?橙皮素（批号13061701） ?黄芩素（批号13082206） 均购自成都曼斯特生物公司，纯度皆>98%；生栀子（产地福建，批号130701）?生大黄（产地甘肃，批号130701）?炒枳实（产地江西，批号130804） ?淡豆豉（产地河南，批号130425）均购于先声药店，经中国药科大学中药学院秦民坚教授鉴定栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实，大黄为蓼科植物药用大黄Rheum officinale Baill的根和根茎，枳实为芸香科植物甜橙Citrus aurantium L. 的干燥幼果，淡豆豉为豆科植物大豆Glycine max L. Merr. 的成熟种子的发酵加工品?甲醇（色谱纯，江苏汉邦科技有限公司）；磷酸（分析纯，南京化学试剂有限公司）；水为娃哈哈纯净水?
1.2 仪器
LC-2010C高效液相色谱仪（日本岛津公司），AnkeTGL-16B高速离心机（上海安亭科学仪器厂），AB135-S电子天平（梅特勒-托利多），AEU-210电子天平（日本岛津公司），XW-80A旋涡混合器（上海医科大学仪器厂），高速多功能粉碎机（上海冰都电器有限公司），RE-52CS型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）?
1.3 动物
健康SD大鼠（清洁级），雄性，体重（250±25） g，购自南京青龙山动物养殖中心?动物许可证号SCXK （浙） 2008-0033?饲养温度为20～25 ℃，饲养环境湿度为（45±10）%?
2 方法
2.1 汤剂的制备
2.1.1 栀子大黄汤（ZZDHD）制备 取栀子9 g，大黄3 g，枳实12 g，淡豆豉24 g，粉碎，加10倍量水浸泡30 min，武火煮沸后，文火煎煮30 min，4层纱布过滤；滤渣重复提取2次，合并3次滤液?滤液经旋转蒸发浓缩后制成ZZDHD冻干粉?
2.1.2 单味枳实汤剂（ZS）的制备 枳实12 g，用全方量药材10倍量的水浸泡30 min，武火煮沸后，文火煎煮30 min，4层纱布过滤；滤渣重复提取2次，合并3次滤液?滤液经旋转蒸发浓缩后制成ZS冻干粉?
2.1.3 冻干粉混悬液中柚皮苷橙皮苷与新橙皮苷的含量测定 ZS，ZZDHD冻干粉混悬液中柚皮苷?橙皮苷与新橙皮苷的含量测定参考文献[10]?
2.2 药代动力学试验
2.2.1 色谱条件 汉邦Phecda色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相0.1%磷酸（A）-甲醇（B），梯度洗脱，程序如下，48% B（0～30 min），52% B（31～41 min），48% B（42～52 min）；流速1.0 mL・min-1；检测波长283 nm；柱温30 ℃；进样量20 μL?
2.2.2 溶液的配制 标准溶液的配制：精密称定柚皮素对照品10.00 mg，橙皮素对照品9.15 mg，分别置10 mL量瓶中，加甲醇溶解，配制成1.000，0.915 g・L-1的柚皮素?橙皮素对照品储备液?分别取储备液适量并混合，用甲醇稀释成柚皮素与橙皮素的系列标准溶液备用?
内标溶液的配制：精密称定黄芩素14.30 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解，配制成1.430 g・L-1的黄芩素储备液?取一定量内标储备液，稀释至14.30 mg・L-1的黄芩素内标溶液?
2.2.3 动物分组与给药 12只SD大鼠 （清洁级） 适应性饲养1周，随机分为2组?分别称取ZZDHD， ZS冻干粉适量，用0.5% 羧甲基纤维素钠配制栀子大黄汤生药浓度为2 g・mL-1（相当于枳实生药质量浓度为0.5 g・mL-1） 的ZZDHD混悬液和枳实生药质量浓度为0.5 g・mL-1的ZS混悬液，灌胃体积为20 mL・kg-1?实验前禁食12 h，自由饮水?各组大鼠分别于灌胃前和灌胃后0.167，0.5，1，2，4，6，8，10，12，16，24，36 h眼眶静脉丛取血0.3 mL于肝素化的离心管中，轻轻混匀，离心（16 000 r・min-1） 3 min，分离血浆置-20 ℃冰箱保存?
2.2.4 血浆样品预处理方法 于10 mL刻度离心管中加入100 μL血浆，10 μL抗坏血酸（200 g・L-1） ，100 μL 4 mol・L-1盐酸，70 ℃水浴条件下加热30 min，室温放冷，加10 μL黄芩素（14.30 mg・L-1） ，加1 mL乙酸乙酯，涡旋5 min，4 000 r・min-1离心10 min，取950 μL上层液体于另一干净刻度离心管中，40 ℃水浴下温和氮气流吹干，加入50 μL初始流动相复溶，涡旋1 min，16 000 r・min-1离心10 min，取上清液?进样分析?
2.2.5 标准曲线及QC样本的制备 用空白血浆配制柚皮素质量浓度为0.100，0.200，0.400，1.00，2.00，4.00，10.0，20.0 mg・L-1的8份含药血浆样品；橙皮素质量浓度为0.091 5，0.183，0.366，0.915，1.83，3.66，9.15，18.3 mg・L-1的8份含药血浆样品?同法配制低?中?高3个浓度的QC样本，使柚皮素质量浓度为0.190，1.90，10.0 mg・L-1；橙皮素质量浓度为0.259，2.59，9.15 mg・L-1?
2.2.6 柚皮素?橙皮素在最优水解条件下稳定性考察 按2.2.5项下方法制备柚皮素质量浓度为1.90 mg・L-1，橙皮素质量浓度为2.59 mg・L-1的含药血浆6份，加入10 μL抗坏血酸 （200 g・L-1），涡旋混匀，3份在最优水解条件下进行水解；另3份不水解?按2.2.4项下的方法进行预处理，按2.2.1项下的色谱条件进行分析?经水解后柚皮素峰面积的均值为A′NA?橙皮素峰面积的均值为A′HE；未经水解的柚皮素?橙皮素峰面积的均值分别为ANA，AHE?
2.2.7 大鼠体内药代动力学参数计算与统计分析 将血浆样品按2.2.4项下方法处理，进样，记录色谱图，按内标法计算各时间点血浆药物浓度，采用DAS 2.0软件对获得的各时间点的血药浓度进行非房室模型拟合，算出相应的药代动力学参数，并采用SPSS 16.0软件对组之间的药代动力学参数进行比较?
3 结果
3.1 方法专属性
分别取大鼠空白血浆?加入柚皮素与橙皮素及内标黄芩素的加药血浆?灌胃栀子大黄汤后大鼠血浆各100 μL，按2.2.4项下方法处理，进样，记录色谱图?结果表明血浆中内源性物质与其他药物代谢物不干扰测定，见图1?
3.2 标准曲线及线性关系的考察
取2.2.4项下的样品预处理方法对2.2.5项下柚皮素?橙皮素系列浓度的血浆样品进行处理，以待 测物质量浓度为横坐标（x） ，待测物峰面积与内标峰面积比值为纵坐标（y） ，采用加权最小二乘法进行线性回归，得柚皮素?橙皮素的线性方程分别y=0.359 4x+0.09 （r=0.996 7） 和y=0.393x+0.161 3（r=0.996 7）?实验结果表明，柚皮素和橙皮素分别在0.100～20.0， 0.091 5～18.3 mg・L-1内线性关系良好；将标准曲线最低点连续进样6针，确定柚皮素的最低定量下限为0.100 mg・L-1，RSD≤15.3%，准确度RE≤9.8%；橙皮素的最低定量下限为0.091 5 mg・L-1，RSD≤15%，准确度RE≤9.2%，均满足方法学要求?
3.3 精密度和准确度考察
取2.2.5项下的低?中?高浓度的QC样本各6份，按2.2.4项下方法进行处理，连续测定3 d，将测得值代入当日的标准曲线计算QC样品的浓度，获得该方法的日内?日间精密度（RSD）和准确度（RE）?实验结果见表1，结果表明该方法的精密度与准确度良好?
3.4 提取回收率
取2.2.5项下低?中?高3个浓度QC样品各6份，按2.2.4项下方法处理后进样分析，以待测物在血浆中经提取处理后的测定值与相应浓度标准溶液测定值相比，计算柚皮素?橙皮素及内标黄芩素的提取回收率?柚皮素低?中?高3个质量浓度 （0.190，1.90，10.0 mg・L-1） 的提取回收率分别为77.9%，79.2%，82.3%；橙皮素低?中?高3个质量浓度（0.259，2.59，9.15 mg・L-1）的提取回收率分别为76.2%，78.4%，82.0%，内标的提取回收率为85.2%?
3.5 稳定性
取2.2.5项下低?中?高QC样本各3份，分别考察了血浆样品-20 ℃/室温反复冻融3次，-20 ℃放置2周的稳定性，样品残渣在-20 ℃条件下放置36 h与样品在4 ℃进样器中放置12 h的稳定性，结果显示柚皮素?橙皮素的变化均在85%～115%，表明样品经历以上过程均稳定?
3.6 柚皮素?橙皮素在最优水解条件下的稳定性结果
柚皮素的破坏程度：1-A′NA/ANA=4.76%?橙皮素的破坏程度：1-A′HE/AHE=5.34%?
结果显示，在加入的的盐酸浓度为4 mol・L-1，70 ℃水浴加热1 h的条件下，待测物柚皮素?橙皮素的破坏程度不大，可以应用于血浆中总柚皮素?总橙皮素浓度的测定?
3.7 冻干粉混悬液中柚皮苷橙皮苷与新橙皮苷的含量与给药剂量的计算
根据2.1.3项下的方法，计算出ZS组每g生药枳实中柚皮苷?橙皮苷?新橙皮苷含量分别为26.92，4.004，38.04 mg；ZZDHD组每g生药枳实中柚皮苷?橙皮苷?新橙皮苷含量分别为28.24，3.70，35.04 mg?故ZS组柚皮苷?橙皮苷?新橙皮苷的灌胃剂量为269.2，40.04，380.4 mg・kg-1；ZZDHD组柚皮苷?橙皮苷?新橙皮苷的灌胃剂量为282.4，37.0，350.4 mg・kg-1?
3.8 大鼠灌胃给药后柚皮素?橙皮素的药代动力学
大鼠灌胃给予ZS，ZZDHD汤剂后，柚皮素?橙皮素血药浓度-时间曲线见图2?总柚皮素与总橙皮素的血药浓度-时间曲线在2组间均存在较大差异，ZS组中总柚皮素?总橙皮素的血药浓度均明显高出ZZDHD组中总柚皮素?总橙皮素的血药浓度?采用DAS2.0软件计算相应的药动参数，并用SPSS 16.0两独立样本的t检验对2组药动学参数进行显著性比较，见表2?
4 讨论
柚皮素和橙皮素都是黄酮类化合物，具有较好的紫外吸收特性?本研究建立了灵敏?简便的HPLC-UV方法，完成了大鼠灌胃给予单味枳实和栀子大黄汤后血浆中总柚皮素和总橙皮素的含量测定，并应用于药动学研究中?由于柚皮素?橙皮素?黄芩素均为弱酸性物质，本实验采用酸性洗脱体系并比较了甲酸?乙酸?磷酸3种洗脱体系，在甲酸和乙酸体系下黄芩素拖尾均较严重，而0.1%磷酸能显著改善黄芩素的拖尾，故最终选用0.1%磷酸-甲醇体系?预实验结果表明，盐酸浓度?水解温度?水解时间均可影响水解过程，通过比较不同浓度的盐酸 （2，4，10 mol・L-1） ，不同水解温度 （70，80，90 ℃），不同水解时间 （0.5，1，2 h） 对水解过程的影响，发现水解温度过高?水解时间过长都会加大柚皮素?橙皮素的破坏程度?综合单因素影响实验?正交实验结果以及柚皮素?橙皮素模拟样本的稳定性实验确定最优水解条件为加入的盐酸浓度为4 mol・L-1，水浴温度70 ℃，水解时间1 h?
根据文献报道，枳实中的柚皮苷?橙皮苷?新橙皮苷进入体内后，很快被肠道中的细菌脱糖基变成苷元[11]，较大比例的柚皮素?橙皮素在血液中与葡萄糖醛酸?硫酸结合形成缀合物[12]?关于柚皮素和橙皮素的药代动力学研究的报道，多数采用酶水解的方法，如马雪琴等[13]采用LC-MS/MS测定柚皮苷?新橙皮苷单体给药后总柚皮素和总橙皮素的药动学特征，但酶水解方法耗时长?花费高?本研究采用盐酸水解的方法将苷键断裂，获得游离总苷元的量，经济且耗时短，对于给药后血浆中总柚皮素和总橙皮素的测定提供了参考?
根据已知文献的结果，给药柚皮苷?橙皮苷?新橙皮苷后血浆中柚皮素?橙皮素达峰时间在6～10 h内[11-15]，且由于其体内过程存在肝肠循环[14-15]，故药时曲线往往不只有1个峰，这与本研究的结果相符?
根据两独立样本t检验的结果，可以看出ZS组和ZZDHD组中柚皮素?橙皮素的药动学参数存在显著性差异?ZS组中总柚皮素的Cmax，AUC0-t分别比ZZDHD组的高出73.5%，65.9%，ZS组中总橙皮素的Cmax，AUC0-t分别比ZZDHD组的高出63.5%，119.1%?相比于ZZDHD组，ZS组中总柚皮素的Cmax增加程度大于总橙皮素Cmax增加程度；而总柚皮素的AUC0-t增加程度却小于总橙皮素AUC0-t增加程度?说明栀子大黄汤中的共存成分抑制了柚皮素?橙皮素在大鼠体内的生物利用度，但对二者的抑制程度存在差异?关于中药其他成分对柚皮素?橙皮素的药动学影响，Fang T Z等[16]单体给药柚皮苷746.7 mg・kg-1时比相当于700 mg・kg-1枳壳生药材给药[17]时达峰浓度提高了2.17倍，但是栀子大黄汤中栀子?大黄?淡豆豉中的成分对柚皮素?橙皮素的药动学影响还不明确，还需要进一步实验探索哪些成分影响了柚皮素?橙皮素的药代动力学?
[参考文献]
[1] Wang H， Feng F， Zhuang B Y， et al. Evaluation of hepatoprotective effect of Zhi-Zi-Da-Huang decoction and its two fractions against acute alcohol-induced liver injury in rats[J]. J Ethnopharmacol， 2009， 126： 273.
[2] Van Acker F A， Schoutenb O， Haenen G R， et al. Flavonoids can replace α-tocopherol as an antioxidant[J]. FEBS Lett， 2000， 473： 145.
[3] Kurowska E M， Spence J D， Jordan J，et al. HDL-cholesterol-raising effect of orange juice in subjects with hypercholesterolemia[J]. Am J Clin Nutr， 2000， 72： 1095.
[4] 黄河胜， 马传庚， 陈志武. 黄酮类化合物药理作用研究进展[J].中国中药杂志， 2000， 25（10）： 589.
[5] 李桃园， 王昕， 赵旋，等. 柚皮素对四氯化碳致小鼠化学性肝损伤中氧化应激介质生成影响的实验研究[J].中国临床药理学杂志， 2010， 26（6）： 420.
[6] Goldwasser J， Cohen P Y， Lin W Y， et al. Naringenin inhibits the assembly and long-term production of infectious hepatitis C virus particles through a PPAR-mediated mechanism[J]. J Hepatol， 2011， 55： 963.
[7] 吴耀松，彭贵军. 枳实消痞丸诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡的研究[J]. 中国实验方剂学杂志，2013，19（16）：278.
[8] Bredsdorff L， Nielsen I L F， Rasmussen S E， et al. Absorption， conjugation and excretion of the flavanones， naringenin and hesperetin from α-rhamnosidase-treated orange juice in human subjects[J]. Brit J Nutr， 2010， 103： 1602.
[9] Khan M K， Huma Z E， Dangles O. A comprehensive review on flavanones， the major citrus polyphenols[J]. J Food Compos Anal， 2014， 33 （1）： 85.
[10] 尧爱珉， 黄金秋， 徐大星，等. RP-HPLC 法测定栀子大黄汤中多种成分的含量及其在方剂配伍研究中的应用[J]. 中国药科大学学报， 2013， 44 （6）： 531.
[11] Liu Y， Xu F G， Zhang Z Z， et al. Simultaneous determination of naringenin and hesperetin in rats after oral administration of Da-Cheng-Qi decoction by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J]. Biomed Chromatogr， 2008， 22 （7）： 736.
[12] Manach C， Morand C， Gil-Izquierdo A， et al. Bioavailability in humans of the flavanones hesperidin and narirutin after the ingestion of two doses of orange juice[J]. Eur J Clin Nutr， 2003， 57 （2）： 235.
[13] 马雪琴， 李辰， 袁林华，等. 枳实总黄酮提取物中柚皮苷和新橙皮苷的大鼠药代动力学[J]. 中国药科大学学报， 2013， 44 （2）： 161.
[14] Sun H， Dong T W， Zhang A H，et al.Pharmacokinetics of hesperetin and naringenin in the Zhi Zhu wan， a traditional Chinese medicinal formulae， and its pharmacodynamics study [J]. Phytother Res， 2013， 27 （9）： 1345.
[15] Zhu Y H， Tong L， Zhou S P， et al. Simultaneous determination of active flavonoids and alkaloids of Tang-Min-Ling-Pill in rat plasma by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. J Chromatogr B， 2012， 904： 51.
[16] Fang T Z， Wang Y G， Ma Y， et al. A rapid LC/MS/MS quantitation assay for naringin and its two metabolites in rats plasma [J]. J Pharmaceut Biomed， 2006， 40： 454.
[17] Zhang J Z， Gao W Y， Hu X， et al. The influence of compatibility of traditional Chinese medicine on the pharmacokinetic of main components in Fructus Aurantii[J]. J Ethnopharmacol， 2012， 144： 277.
Effect of different compatibility of Zhizi Dahuang decoction on
pharmacokinetics of naringenin and hesperetin
LIU Xiao-yu， FENG Fang
（1. Department of Pharmaceutical Analysis， China Pharmaceutical University， Nanjing 210009， China；
2. Key Laboratory of Drug Quality Control and Pharmacovigilance， Ministry of Education，
Pharmaceutical University， Nanjing 210009， China）
[Abstract] An HPLC-UV method was developed for the determination of total naringenin and total hesperetin in rat plasma after oral administration of Citrus aurantium Immaturus extracts and Zhizi Dahuang decoction. Plasma samples were pretreated with liquid-liquid extraction procedure and acid hydrolysis method was used for converting conjugated naringenin and hesperetin to their respective free forms. Plasma samples were separated on a C18 column（4.6 mm×150 mm，5 μm）， using 0.1% phosphoric acid and methanol as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL・min-1 with gradient elution. DAS 2.0 software was applied to calculate the pharmacokinetic parameters while the SPSS 16.0 software was used for statistical analysis. Significant differences were observed， the Cmax，AUC0-t of total naringenin in ZS group was 73.5% and 65.9% higher than those in ZZDHD group， respectively； the Cmax， AUC0-t of total hesperetin in ZS group was 63.5% and 119.1% higher than those in ZZDHD group， respectively. There is a obvious decrease in Cmax and AUC0-t of total naringenin and total hesperetin after compatibility and their pharmacokinetic characteristics changed greatly due to the combination of other herbs. The established method was rapid， sensitive， selective and accurate， and it could be applied in the determination of total naringenin and total hesperetin in rat plasma.
[Key words] Zhizi Dahuang decoction； compatibility； HPLC-UV； total naringenin； total hesperetin； pharmacokinetic characteristics
doi：10.4268/cjcmm20141338