高效免疫调节剂对人宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

摘 要：目的：观察高效免疫调节剂（HIS）对人宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。方法：制备HIS含药血清，采用MTT法检测HIS含药血清对HeLa细胞增殖的影响，AnnexinⅤ/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡。结果：与对照组比较，HIS含药血清对HeLa细胞生长有一定的抑制作用（p

关键词：高效免疫调节剂；人宫颈癌HeLa细胞；增殖

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，严重威胁广大妇女的生命和健康。宫颈癌的治疗是一个及其复杂的过程，如何纠正宫颈癌患者的整体免疫系统恢复到正常和协调上来，恢复机体的免疫监视，防止肿瘤的发生、发展和转移是宫颈癌治疗的关键之一。为此，我们采用多价疫苗组成的高效免疫调节剂（high-efficiency immune modulators， HIS），制备成含药血清，对人宫颈癌HeLa细胞进行体外培养，观察HIS对宫颈癌细胞增殖的影响。

1 材料

1.1 动物及细胞株

雄性SD大鼠，体重250-280g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司（动物中心许可证号：SCXK（湘）2011-0003，动物合格证号：43004700003244，级别：SPF级）。人宫颈癌HeLa细胞人肝癌细胞株Bel-7402，由中国医学科学院医药研究所购进，赣南医学院科研中心传代培养。

1.2 药品和试剂

胎牛血清（Gibco，10099-141）、1640培养基（Gibco，12800-058）、0.25%胰酶（Gibco，25200-056）、MTT Formazan（Sigma，M2003-1G）、PI Annexin Ⅴ apoptosis detection kit（美国BD公司，3018688）

2. 方法

2.1 实验药物配置

HIS（中国发明专利申请号：200810107096.6）由江中肿瘤治疗研究组提供，将其配置成0.3 g/mL，此为中剂量，再分别浓缩、稀释成0.9 g/mL、0.1 g/mL，此为高、低剂量。4℃冰箱保存，大鼠按0.1 mL/100 g腹股沟皮下注射给药，每日一次。

2.2 含药血清制备

将20只清洁级SD大鼠随机分成4组：A、正常对照组；B、HIS低剂量组；C、HIS中剂量组；D、HIS高剂量组。A组每天腹股沟皮下注射生理盐水0.1mL/100g；B、C、D组分别给予低、中、高剂量HIS腹股沟皮下注射0.1mL/100g；连续治疗3天，于末次给药1h后，乙醚麻醉，腹主动脉取血，分离血清。将同组大鼠血清混匀， 56℃，30min水浴灭活，0.22μm薄膜滤菌器过滤，密封冷藏备用。

2.3 宫颈癌细胞HeLa的复苏与培养

HeLa细胞株复苏，CO2孵箱（5%CO2，37℃，95%湿度）传代培养，3代后用于以下实验。

2.4 MTT法检测HIS含药血清对HeLa细胞增殖的影响

将细胞数量调整为5×10/mL接种至96孔培养板，每孔200uL，分4组（正常血清对照组，HIS含药血清低、中、高剂量组），每组8个复孔，培养24h后弃培养液， 加含10%各组相应血清的1640培养液，继续培养24h、48h、72h后，每孔加入MTT 20μL，37℃作用4h，弃培养液，加入二甲基亚砜 100μL，37℃、l0min轻轻摇动培养板，上机检测，计算细胞增殖抑制率。

2.5 AnnexinⅤ/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡

常规培养24h后弃培养液， 加含10%相应血清的1640培养液继续培养48h，弃培养液，胰酶消化，收集细胞，离心，弃上清。取适量AnnexinⅤ Binding Buffer 重悬，计数，调细胞剂量为1×106个/mL，取40uL 细胞（即4×104个）放入离心管中。每管加AnnexinⅤ、PI各2uL，混合后避光放置15min，上机检测。

3 实验结果

3.1 HIS含药血清对HeLa细胞增殖的影响

与对照组比较，各组HIS含药血清对HeLa细胞生长有一定的抑制作用（p

3.2 AnnexinⅤ/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡

实验结果表明，随着HIS剂量的增加，细胞凋亡比例亦相应增加，分别为：（11.26±1.59）%、（17.67±1.72）%、（24.58±1.86）%，与正常血清对照组（6.92±1.07）%比较有显著性差异（p

4 讨论

宫颈癌是指发生在宫颈阴道部或移行带的鳞状上皮细胞及颈管内膜的柱状上皮细胞交界处的恶性肿瘤，其治疗是一个复杂的过程，目前临床常见的治疗手段是手术和放、化疗，其疗效值得肯定，但仍存在着一些弊端和毒副作用。

在动物实验中，我们观察了HIS对S180肉瘤小鼠肿瘤的影响，结果证实HIS可有效增强小鼠免疫功能[1]，同时促进肿瘤细胞凋亡 [2]。本次实验我们制备HIS含药血清，对人宫颈癌HeLa细胞进行体外培养，观察HIS对宫颈癌细胞增殖的影响。结果表明HIS能够有效抑制HeLa细胞的增殖，促进细胞凋亡，这为进一步在临床应用HIS治疗宫颈癌提供了实验依据。

参考文献

[1]常欣峰，宋春花，罗宝英，等. 高效免疫调节剂对S180肉瘤小鼠IL-6及IL-10表达的调节作用[J].长春中医药大学学报，2013，29（12）：958-960.

[2]常欣峰， 宋春花， 张志花，等. 高效免疫调节剂促进肉瘤小鼠肿瘤细胞凋亡实验研究[J].吉林中医药，2013，33（7）：717-719.