铝离子对神经细胞突触生长的影响

摘要：为了探讨金属铝离子在小鼠神经细胞生长分化中的影响，采用小鼠大脑皮层细胞作为实验材料，在细胞生长分化过程中加入浓度不同的金属离子，等细胞生长至14 d时，对细胞进行免疫荧光染色，使用激光共聚焦显微镜对细胞进行拍照，并利用ImageJ软件和GraphPad Prism 5.01软件对神经细胞突触的数目和大小进行统计学分析。结果表明：在铝离子浓度较低的情况下，不会对神经细胞的突触数目和突触大小造成影响；随着铝离子浓度的升高，作用时间越长，对神经细胞损伤越大，直至神经细胞全部死亡；而其影响主要表现在使突触数量减少，而对突触的大小并没有显著的影响。

关键词：小鼠大脑神经细胞；神经细胞分化；铝离子；突触形成

中图分类号：Q253

文献标识码：A文章编号：16749944（2017）8022903

1引言

自闭症谱系障碍（ASD）和阿尔兹海默症（AD）均是由突触功能障碍或突触病变引起的神经系统疾病[1]。突触形成和突触功能的完善受到特定基因的调控，突触功能障碍和突出病变与这些基因紧密相关。但是，基因外其他因素的影响同样不容忽视。体内金属离子含量失衡就是其中一个很重要的因素[2，3]。过去，很多研究用以证明人体内的各种金属离子的重要性和毒性，这些研究发现，金属离子对人体是否有害是有一个安全值的。当低于此安全值，有的金属对人体是无害的，甚至是不可缺少的；当超过这个安全值，即便是人体必须的金属元素，都会对人体造成伤害[4]。

随着现在人们使用金属制品的增多，人们对金属离子特别是有毒金属离子的摄入量也随之增加，其在人体内长期蓄积，对机体神经系统的发育和功能产生干扰，当其浓度超过了安全值，便会对神经细胞造成伤害。在对自闭症和阿尔兹海默症患者的头发样品鉴定中发现，Zn、Ca、Fe、Mg、Mn和Se明显低于正常人；同时，Al、As、Cd、Hg和Pb的浓度偏高[5，6]。而且，症状的严重程度与体内有毒金属含量有很大关系[7]。

为了探究铝离子对神经细胞生长分化特别是突触形成的具体影响及其作用机制，利用体外培养的小鼠大脑皮层神经元细胞，在不同的时间向细胞培养基中加入梯度浓度的AlCl3溶液，然后利用免疫荧光染色，对神经细胞突触的数量和大小进行记录并对实验数据进行统计学分析。试验结果表明：在金属浓度比较低时，无论作用时间长短，对神经细胞突触形成均没有影响；当Al离子浓度高于200 μM后，离子浓度越高，作用时间越长，对神经突触的伤害越大，直至神经细胞全部死亡，而且金属离子对神经细胞的影响主要表现在对突触数目的影响，而对突触的大小并没有显著影响。

2材料与方法

2.1材料

小鼠大脑皮层神经元细胞。胎牛血清（FBS，生化试剂，Gibco公司）；B-27；运铁蛋白（Transferrin）；胰蛋白酶（Gibco公司）；葡萄糖（Glucose）；HEPES；盐酸阿糖胞嘧啶（Ara-C）；多聚-L-赖氨酸；AlCl3。

2.2试剂与仪器

相差显微镜（奥林巴斯CKX41）；超净工作台（苏州净化）；二氧化碳培养箱（Thermo Fisher）；共聚焦显微镜（Nikon）。

2.3方法

2.3.1实验溶液配制

利用胎牛血清、DMEM等试剂配置实验所需的细胞培养基及相关缓冲液。所有溶液均需调整渗透压和pH值至适宜细胞生长的实验进行的值，并以适当方式进行除菌[8]。

2.3.2小鼠大脑皮层细胞培养

新生野生型小鼠，分离其大脑皮层与海马细胞，用0.25% Trypsin-EDTA消化酶消化12 min，消化完成后用培养基终止消化，然后将大脑皮层细胞与海马细胞吹打下来，加入镀有多聚赖氨酸的玻片上进行培养，分别在培养第1、4、9 d进行换液，同时向培养基中加入不同浓度的金属离子溶液。第1 d为神经元换无Ara-C的生长培养基，第4、9 d换含4 μM Ara-C 生长培养基[8]。培养14d后进行免疫荧光染色。

2.3.3细胞免疫荧光染色

用4%多聚甲醛（PFA）在4 ℃环境中固定12 min；用1x的PBS清洗1次之后，用0.2% TritonX-100对神经细胞室温通透5 min，然后用1x的PBS浸洗5 min；用5%牛血清白蛋白（BSA）室温封闭30 min；吸去BSA后，一抗室温孵育2 h；然后用1x的PBS浸洗3次，每次5 min；加入荧光二抗，室温孵育30 min，在加入荧光二抗之后，所有的操作应注意避光；30 min后，用1x的PBS浸洗5次，每次5 min，最后用含抗荧光淬灭剂的封片液封片。封片完成后，在荧光显微镜下观察并采集图像。

2.3.4数据处理

将所得图片使用软件Image J （National Institutes of Health）M行分析：随机选取神经细胞的轴突，把直径大于0.42 μm且小于12.6 μm的点视为突触，并测量该段轴突的长度。将所获得的突触的数量和大小用Graph pad Prism 5.01（Graph Pad Software，Inc）软件进行统计学分析，并对实验组与对照组进行t检验，并使用Adobe Illustrator CC （Adobe Corporation）进行统计图绘制。

3结果

3.1第1d加入Al离子对小鼠神经细胞突触形成的影响

研究表明，在ASD和AD患者的病因主要是突触功能障碍和突触病变，而更深层次的原因是基因和基因为因素的共同影响。在ASD和AD患者体内，Al离子浓度明显升高，且与患者的症状严重程度成正相关。为了探究Al离子对神经细胞生长分化特别是对突触生长的影响，我们选取小鼠大脑皮层神经细胞，分别在培养的第1、4、9 d，向培养基中加入梯度浓度的AlCl3溶液，浓度梯度为：10 μM，100 μM，200 μM，300 μM，500 μM。在培养14 d以后，对细胞进行免疫荧光染色，然后利用激光共聚焦显微镜对细胞进行成像，并对数据进行分析处理，然后再对三次独立重复试验进行统计学分析。

在胞生长第1 d加入AlCl3溶液，并培养14 d以后，10 μM，100 μM组别与对照组相比，无论单位长度的突触个数，还是突触大小，并没有明显差异。在200 μM，300 μM组别中，与对照组相比，单位长度的突触个数明显减少，但是突触的大小并没有明显差异。在500 μM的组别中，神经细胞已全部死亡。这说明，当Al离子浓度较低时，不会对神经细胞的突触形成造成影响，而当其浓度超过一定范围，便会对突触形成带来危害，如果浓度过高，则会导致神经细胞死亡（图1）。

3.2第4 d加入Al离子对小鼠神经细胞突触形成的影响

第4 d加入的AlCl3溶液浓度梯度为：10 μM，100 μM，200 μM，300 μM，500 μM，培养14 d之后，进行免疫荧光染色，利用共聚焦显微镜成像，用Image J对图像进行分析，将所得数据进行统计分析，然后将3次独立重复试验进行统计学分析，其结果如图2。

在第4 d加入AlCl3溶液后，10 μM，100 μM，200 μM，300 μM的组别无论单位长度内的突触个数还是突触的大小与对照组相比均没有明显差异，但500 μM的组与对照组相比，单位长度的突触个数有明显差异，但突触大小仍没有明显差异。这说明，随着作用时间缩短，同样浓度的Al离子对突触的形成造成的危害程度会相应的降低，但是高浓度的Al仍然会对突触造成伤害。

3.3第9 d加入Al离子对小鼠神经细胞突触形成的影响

第9 d加入的AlCl3溶液浓度梯度为：10 μM，100 μM，200 μM，300 μM，500 μM，培养14 d之后，进行免疫荧光染色，利用共聚焦显微镜成像，用Image J对图像进行分析，将所得数据进行统计分析，然后将3次独立重复试验进行统计学分析，其结果如图3。

结果显示，在第9 d加入AlCl3溶液后，各实验组与对照组相比，无论单位长度的突触数量还是突触的大小，均没有明显差异。

由以上结果可以得出，当AlCl3 浓度较低时，不会对小鼠大脑皮层神经细胞的突触生长造成影响，且与作用时间长短无关；当AlCl3的浓度超过200 μM时，如果作用时间较短，对突触生长并无明显影响，如果作用时间较长，便会对突触的生长造成危害；如果浓度过高，作用时间过长的话，甚至会导致神经细胞死亡。这说明，当作用时间过短时，在我们的浓度梯度内，不会对神经细胞的突触形成造成危害。不过，也有可能此时神经突触已经形成，加之Al离子作用时间过短，无法对其造成影响。

4讨论

由于本实验研究对象为神经细胞，所以选取小鼠大脑皮层神经细胞作为实验材料，均为原代培养，所用小鼠为新生野生型小鼠。通过在小鼠神经细胞生长的培养基中加入梯度浓度的AlCl3溶液，通过采集小鼠神经细胞单位长度突触的数目和突触的大小等数据，来研究不同浓度的铝离子对小鼠神经细胞突触形成的影响。

对所采集到的数据进行统计学分析后发现：当Al离子浓度低于200 μM时，无论对小鼠神经细胞作用时间长短，均未对神经细胞的突触个数和大小产生影响；当Al离子浓度超过200 μM，Al离子对神经细胞作用时间越长，对神经细胞突触的形成的影响越大，单位长度的突触数量显著减少，但突触的大小并没有显著改变；当Al离子浓度过高（达到或超过500 μM），作用时间过长的情况下，会直接导致神经细胞全部死亡。这说明，Al离子在人体内蓄积，特别是在神经系统内蓄积的时候，对神经细胞的生长分化是十分不利的。

另外，现有研究发现，Al离子对神经系统的损伤是一个非常复杂的过程，而且可以通过多种方式对神经系统造成伤害：一方面，铝离子不仅能够非竞争性抑制乙酰胆碱脂酶，产生神经毒性作用，触发β-折叠，促进神经原纤维缠结形成，干扰神经传导和诱导细胞的氧化损伤而发挥直接的毒性作用[9，10]；另一方面，还能够作用于小分子物质，调节血清的金属动态平衡，促进铁介导的氧化反应而间接发挥毒性作用[11]。

神经系统的结构组成与功能实现完全取决于神经细胞的生长及分化，而突触联结是神经环路中不同神经元之间信息传递的关键节点，因此可以说神经细胞的生长分化中重要的部分就是神经突触的形成。因此，研究神经细胞突触的形成及其影响因子是研究生物神经系统的重要部分；同时对突触功能障碍或突触病变类疾病的医学探究和病理学研究也具有极大意义。

参考文献：

[1]

Kang H J， Voleti B， Hajszan T， et al. Decreased Expression of Synapse-Related Genes and Loss of Synapses in Major Depressive Disorder[J]. Nature Medicine， 2012， 18（9）：1413～1417.

[2]Grabrucker A M. Environmental factors in autism[J]. Frontiers in Psychiatry，2013（3）：118.

[3]Nuttall J R， Oteiza P I. Zinc and the aging brain[J]. Genes & Nutrition， 2014， 9（1）：1～11.

[4]Liebscher K， Smith H. Essential and nonessential trace elements. A method of determining whether an element is essential or nonessential in human tissue[J]. Archives of Environ-mental Health，1968，17（6）：881～890.