细胞外基质复合温敏性水凝胶与膀胱上皮细胞的生物相容性

[摘要] 目的 检验细胞外基质/温敏性水凝胶（ECM/TSH）复合支架材料与膀胱上皮细胞（UC）的生物相容性，探索其作为泌尿道组织工程支架的可行性。 方法 实验分为A、B、C三组，A组为ECM/TSH复合支架种植UC组；B组为单纯ECM种植UC组；C组为单纯培养UC组，另设无细胞培养液为空白组（D组）。应用角蛋白免疫荧光染色技术鉴定细胞，应用倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞的黏附和生长情况，利用MTT法检测细胞的活力。结果 光镜下ECM/TSH复合支架为红染的网状结构，纤维较粗，网孔较小，未见到细胞碎片；种植UC后4 h可见细胞紧密黏附于材料表面；14 h可见细胞沿支架纤维伸展；3 d时可见黏附于材料的细胞增多、增殖明显；扫描电镜下，可见发育良好的细胞伪足沿纤维伸展，附着牢固，细胞间连接紧密，胞膜表面有ECM分泌。MTT法示各组间细胞相对增殖率差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 ECM/TSH复合材料具有便于细胞黏附和生长的微孔结构，生物相容性好，无细胞毒性，是一种理想的组织工程材料。

[关键词] 温敏性水凝胶；细胞外基质；复合支架材料；生物相容性

[中图分类号] R318.08 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）04（a）-0026-03

支架材料是组织工程学研究的重要内容之一。理想的组织工程支架材料必须具有良好的生物相容性，而且适合种子细胞在支架上黏附、生长[1]。温度敏感性水凝胶（temperature sensitivity hydrogel，TSH）又被称为温固化水凝胶，当温度超过相变温度时，黏度急剧增高，由液态变为凝胶态[2]。本研究小组在前期已证实经TSH改良的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）所制备的复合支架材料与膀胱平滑肌细胞具有良好的相容性[3]。为给体内研究提供更充足的实验依据，本研究将进一步探索该支架材料与膀胱移行上皮的生物相容性。

1 材料与方法

1.1 主要材料与设备

新西兰兔由武汉大学实验动物中心提供；主要试剂有：PEO-PPO-PEO 三嵌段共聚物（购于BASF公司），小鼠抗兔细胞角蛋白单克隆抗体（AE1/AE3）（购于Santa Cruz 公司），FITC标记羊抗小鼠单抗隆抗体（购于Abcam公司），磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS），甲醇、丙酮、戊二醛，DMEM F12培养基，Dispase酶，Ⅱ型胶原酶，胎牛血清（fatal bovine serum，FBS），二甲基亚砜（DMSO）、MTT均购于Sigma公司。相差倒置显微镜（日本OLYMPUS），恒温培养箱（日本Napco公司），超净操作工作台（北京半导体设备一厂），扫描电子显微镜（日本SANYO）。

1.2 方法

1.2.1 兔膀胱移行上皮细胞的原代培养及鉴定 选用4周龄新西兰兔，雌雄不限，体重2.0～2.5 kg，空气栓塞处死后，无菌条件下取膀胱前壁组织（2 cm×2 cm），小心分离膀胱黏膜与肌层，将黏膜层组织迅速置入含庆大霉素（20 μg/mL）的PBS中浸泡并漂洗3次。将黏膜组织剪碎成1 mm2大小的组织块，转入新鲜配制的Dispase酶消化液中，于4℃下消化18 h后再用PBS洗涤1次，用不锈钢网滤去组织残块，收集细胞悬液于混合消化液（0.02%EDTA + 0.25%胰酶）中。37℃振荡消化10 min，每2分钟吹打1次，直至成为单细胞悬液，加入FBS终止消化，PBS洗涤3遍，离心8 min（1000 r/min），弃上清，用培养液吹打混匀，再将细胞接种到含10%FBS的DMEM-F12培养基中，置37℃恒温、5%CO2饱和湿度孵箱内常规培养。

将上述培养的细胞传2～4代后接种于盖玻片上再培养2 d，待细胞完全贴壁后，以PBS液冲洗，甲醇、丙酮固定10 min，以小鼠抗兔细胞角蛋白单克隆抗体（AE1/AE3）为一抗，以FITC标记羊抗小鼠单抗隆抗体为二抗，孵育、中性树胶封片，于490 nm的蓝色荧光倒置显微镜下观察。以PBS代替一抗作为空白对照。

1.2.2 ECM/TSH复合支架的构建 参考本小组前期研究[3]的方法制备TSH，使用前紫外线照射30 min备用。参照Yang等[4]报道的方法制备ECM，将成品分成32块（1 cm×1 cm），经冷冻干燥后，环氧乙烷消毒，干燥保存于4℃。在低温（4℃）真空环境下，将16块制备的ECM浸入TSH溶液中1 h，取出后经低温冷冻干燥机冻干，分装密封，经环氧乙烷消毒，常温干燥保存备用。

1.2.3 细胞相容性 实验分为四组，每组16孔，A组：ECM/TSH复合支架种植膀胱上皮细胞组；B组：单纯ECM种植膀胱上皮细胞组；C组：单纯培养膀胱上皮细胞组；D组：无细胞培养液组。种植细胞前先用培养液将支架材料预湿，取第3代膀胱上皮细胞悬液（浓度1×105/mL）50 L缓慢接种于材料上，4 h后再加入DMEM F12培养基（含FBS），置37℃恒温、5%CO2饱和湿度孵箱内培养，2 d后换液，倒置相差显微镜下观察细胞黏附、生长情况。

1.2.4 膀胱上皮细胞生长情况扫描电镜观察 膀胱上皮细胞与支架材料复合培养48 h后，A、B组各取一块材料/细胞复合物，经过PBS漂洗3次，3%戊二醛、2%的四氧化锇双重固定、脱水、醋酸异戊酯置换、干燥、喷金， 扫描电镜观察。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 原代培养细胞形态

细胞接种时呈圆形，大小均一，轮廓清晰，胞浆透亮。接种24 h后，可见细胞贴壁生长，细胞密集生长区域可见细胞伸展后相互连接呈簇状，呈散在的簇片状分布，细胞间连接紧密，形态呈典型的“铺路石样”表现，符合上皮细胞特征。3 d后细胞进入对数生长期，7 d可连接成片，长满整个培养瓶底部。

2.2 组织学检查

2.2.1 种植细胞前后的复合支架材料 倒置相差显微镜下观察：ECM为网状结构，HE染色后可见红染的胶原纤维规则排布，纤维较细，网孔较大，未见到细胞碎片；复合TSH后胶原直径变粗，网孔孔径变小。种植膀胱上皮细胞后4 h，光镜下可见细胞紧密黏附于材料表面，少数散落到培养瓶底贴壁生长。加入培养基10 h，可见细胞已伸展，有多个突起。培养3 d时，黏附于材料的细胞数量增加，细胞增殖明显。

3 讨论

组织工程学是综合应用工程学和细胞生物学的原理，将体外培养扩增后的种子细胞与可降解的生物支架材料相复合，再将其回植体内缺损部位，从而再生成具有正常结构和功能的组织，达到真正意义上的生物学修复[5-6]。材料的生物相容性检测是该领域不可缺少的重要组成部分，理想的组织工程支架材料应当具有良好的细胞相容性、能够促进细胞增殖和组织形态的形成，为此本小组做了系列研究[7-8]。

与笔者前期研究结果相似，本实验中ECM/TSH复合材料比单纯ECM，纤维直径变粗，网孔孔径变小，与接种细胞的接触面积增大。经TSH修饰以后的ECM对细胞表现出更强的黏附性，为细胞的附着、生长、增殖提供了良好的微环境。超微结构观察显示，植入的膀胱上皮细胞能够紧密地附着于ECM胶原纤维之上，细胞之间形成紧密联结，周围可观察到ECM的分泌。MTT检测结果表明膀胱上皮细胞易于在ECM/TSH复合支架材料上生长，增殖情况较好，符合膀胱黏膜上皮细胞的生长规律，细胞未见凋亡和分化，实验结果提示ECM/TSH复合支架材料与膀胱黏膜上皮细胞具有良好的生物相容性，为下一步应用于体内研究提供了实验依据。

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（收稿日期：2013-01-15 本文编辑：卫 轲）