小球藻适宜碳源及营养方式研究

摘要：筛选小球藻（Chlorella sp.）的适宜碳源，比较研究小球藻在不同营养方式下的生长情况。结果表明，葡萄糖能显著促进小球藻生长，且小球藻可利用葡萄糖在化能异养、光激活异养、光异养及兼养条件下均可生长，其比生长速率从大到小依次为：兼养、光异养、光激活异养、化能异养及光合自养。兼养培养比生长速率接近于光合自养和光异养培养下的比生长速率之和。

关键词：小球藻（Chlorella sp.）；微藻；适宜碳源；异养；兼养

中图分类号：S968；Q949.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）24-6030-04

随着化石燃料的日益枯竭，现代社会依靠化石燃料的现状遭到了严重的挑战[1]。依照人类对化石燃料的消耗速率和现已探明的地球化石燃料储量，化石燃料可能在未来50年消耗殆尽。因此，探寻可再生能源已迫在眉睫。生物柴油被认为是最有望代替化石燃料的可再生能源[2，3]。由于传统的植物油和动物脂肪的短缺，不能满足生物柴油生产的原料供给[4]，微藻以其高生长速率、高油脂产率和生长空间广阔等优势被认为是最具潜力的生物柴油原料[5]。然而在微藻自养培养生产生物柴油的过程中也遇到了瓶颈问题。微藻在光合自养（Photoautotrophy）条件下生长速度缓慢，藻液浓度低，增加了微藻采收的成本[6]，使微藻制生物柴油用于商业生产的经济可行性很低[7]。解决这一问题的方法之一是在自养培养基中添加外加碳源，使微藻利用外加碳源进行异养（Heterotrophy）或兼养（Mixotrophy）生长。

与高等植物相比，微藻不仅可以利用光能和CO2进行光合自养生长，而且可以利用外加碳源进行异养和兼养生长。光合自养的光抑制性是限制微藻生物量增加的主要原因，异养培养以外加碳为碳源和能源[8]，能够降低光合自养培养的不足。Zheng等[9]通过异养培养Chlorella sorokiniana所得微藻细胞浓度是自养培养的3.3倍。异养培养和兼养培养不仅能提高微藻的生物量，还可以改变其油脂含量[10]，缪晓玲等[11]通过异养转化细胞工程技术获得了油脂含量高达57.9%的异养小球藻，使油脂含量在光合自养的基础上提高了4倍。

小球藻（Chlorella sp.）为绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻，是一种球形单细胞淡水微藻。目前，用于产油制生物柴油的小球藻主要有原始小球藻（Chlorella protothecoides）和普通小球藻（Chlorella vulgaris）等，关于小球藻培养的研究报道主要集中在自养培养和异养培养方面[12-14]，但对小球藻的自养、化能异养（Chemoheterotrophy）、光激活异养 （Light-activated heterotrophic growth，LAHG）、光异养（Photoheterotrophy）和兼养培养的系统比较研究报道较少。本研究对小球藻适宜碳源和其营养方式进行了比较试验，以期得到高密度培养小球藻的适宜培养方式，为微藻炼制生物质燃料以及充分利用这一资源的其他领域提供相关数据。

1 材料与方法

1.1 藻种

小球藻购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库。

1.2 培养基与试剂

SE基础培养液（1 L）： NaNO3 250 mg， K2HPO4 75 mg， MgSO4·7H2O 75 mg， CaCl2·2H2O 25 mg， KH2PO4 175 mg， NaCl 25 mg， FeCl3·6H2O 5 mg， EDTA-Fe 1 mL， Trace mental solution 1 mL， 土壤提取液 40 mL， 蒸馏水958 mL。

试剂： 葡萄糖，丙酮酸钠，乙酸钠，碳酸氢钠，碳酸钠，3-（3，4-二氯苯基）-1，1-二甲脲（DCMU，购于Sigma公司），头孢噻肟钠。

1.3 培养条件

将配制分装好的培养基在高压灭菌锅中121 ℃灭菌20 min，灭菌后冷却至室温，添加头孢噻肟钠至0.5 g/L防止染菌。在超净台中将生长至对数期的微藻接种于含150 mL培养基的250 mL锥形瓶中（接种量20% V/V）于温度30 ℃、平均光照度5 000 lx的培养箱中培养，光暗比12 h∶12 h。

1.4 试验设计

1.4.1 小球藻适宜碳源选择 选取葡萄糖、丙酮酸钠、乙酸钠、碳酸氢钠和碳酸钠作为小球藻的外加碳源，外加碳源浓度为0.1 g/L（按碳含量计，本试验所添加的碳源浓度均以碳含量计。下同），每组设3个平行试验，进行兼养培养。每隔24 h测定其生物量。

1.4.2 小球藻培养方式选择 光合自养培养：将微藻接种于SE基础培养基中，在光照条件下培养。设置3个平行试验，每隔24 h测定其生物量。

兼养培养：在SE培养基中添加碳浓度0.2 g/L的葡萄糖，于光照条件下培养。设置3个平行试验，每隔24 h测定其生物量。

化能异养：在SE培养基中添加碳浓度0.2 g/L的葡萄糖，将锥形瓶用黑色布袋包裹，于完全黑暗条件下培养。设置3个平行试验，每隔24 h测定其生物量。

光激活异养：在SE培养基中添加碳浓度0.2 g/L的葡萄糖，将锥形瓶用黑色布袋包裹，于完全黑暗条件下培养，每24 h取下布袋，以5 000 lx脉冲式短波照射10 min。设置3个平行试验，每隔24 h测定其生物量。

光异养：在SE培养基中添加碳浓度0.2 g/L的葡萄糖，并添加10-6 mol/L 3-（3，4-二氯苯基）-1，1-二甲脲（DCMU），于光照条件下培养。设置3个平行试验，每隔24 h测定其生物量。

1.5 分析方法

式中μ为比生长速率（d-1），N1和N0分别为T1时刻和T0时刻时小球藻的细胞密度。

微藻干重测定：培养至10 d后，取100 mL藻液于8 000 r/min离心5 min，用蒸馏水洗2次，置于已恒重的称量瓶中，105 ℃下烘干至恒重，用分析天平称量，所得质量减去称量瓶质量为小球藻细胞干重。

2 结果与讨论

2.1 小球藻适宜碳源选择

碳源是微藻异养、兼养生长最关键的影响因素，选择合适的碳源对微藻异养、兼养生长的生物量产量和产物组成起到极为关键的作用。不同的微藻对碳源的需求不同，一些微藻既能利用有机碳又能利用无机碳进行兼养生长，同时进行呼吸过程和光合作用[16]。本研究以3种有机碳和2种无机碳为碳源，对小球藻生物量的影响见图1，对小球藻比生长速率的影响见图2。从图1可以看出：小球藻均能利用葡萄糖、丙酮酸钠、乙酸钠、碳酸氢钠和碳酸钠进行生长，添加碳源的试验组生长状况均显著优于未添加碳源的对照组，其生物量分别是自养生长的3.1、2.7、1.6、2.0、1.5倍。从图2可以看出：添加碳源的试验组比生长速率分别是自养生长的2.5、2.4、1.6、2.0、1.7倍。其中，葡萄糖对小球藻生长的促进作用最为明显，最终生物量和比生长速率分别是对照组的3.1和2.5倍。其原因可能与相同物质量的碳源所含能量不同有关，如葡萄糖在代谢中能产生大约2.8 kJ/mol的热量。

2.2 小球藻适宜培养方式

大量研究表明，许多微藻有利用外加碳源进行兼养和异养生长的能力。如鱼腥藻（Anabeana）HB1017株能利用果糖、葡萄糖、蔗糖为底物进行化能异养生长[17，18]。集胞藻（Synechocystis sp.）PCC6803可以在每天短时光照（5 min）条件下利用葡萄糖进行光激活异养[19，20]，三角褐指藻（Pheaodactylum tricornutum Bohlin）具有兼养生长的能力[21]。

本试验对小球藻自养、兼养和异养进行比较研究，结果如图3和图4所示。小球藻能利用葡萄糖进行化能异养、光激活异养、光异养和兼养生长。在化能异养和光激活异养条件下，小球藻颜色依然为绿色，但生长缓慢。在添加DCMU的光异养条件下，小球藻生长状况优于化能异养和光激活异养，但培养12 d以后因葡萄糖耗尽而死亡。由于DCMU是光合作用抑制剂，在培养基中加入DCMU后，微藻细胞光系统Ⅱ的活性被抑制，阻断了非环式电子传递，NADPH产生受阻，CO2不能被微藻同化吸收[22-24]。所以当葡萄糖被耗尽时，如不再添加碳源，微藻细胞由于缺少生长所必需的碳源而死亡。在本试验培养条件中，小球藻在兼养条件下的生长状况最好，兼养培养兼有光合自养与异养代谢的性质，大多数微藻兼养的比生长速率等于异养培养与自养培养比生长速率之和（μ兼养=μ异养+μ自养）。在光合自养条件下，CO2作为惟一碳源维持微藻生长，而在光异养条件下，非环式电子传递被阻断，CO2不能被同化吸收，微藻只能利用有机碳进行生长，由图4可知，小球藻光合自养比生长速率（0.13）和光异养比生长速率（0.19）之和（0.32）非常接近于兼养比生长速率（0.33），基本可以认定小球藻兼养培养比生长速率等于光异养培养与自养培养比生长速率之和（μ兼养=μ异养+μ自养）。培养10 d后，所得生物量产率如表1所示，小球藻化能异养、光激活异养、光异养和兼养生长的生物量产率分别是自养生长的1.3、1.5、2.2、5.9倍。由此可知，兼养培养是获得小球藻高密度、高产量、短周期培养的最佳营养方式。

3 结论

小球藻能利用多种外加碳源进行异养兼养生长，在本试验所选的3种有机碳和2种无机碳源中，葡萄糖促进其生长的效果最为明显。

小球藻比生长速率从大到小依次为：兼养、光异养、光激活异养、化能异养及光合自养，其中兼养的比生长速率等于光合自养培养与光异养培养比生长速率之和。小球藻化能异养、光激活异养、光异养和兼养生长的生物量产率分别是自养生长的1.3、1.5、2.2、5.9倍。兼养培养是获得小球藻高密度、高产量、短周期培养的最佳营养方式。

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