RP―HPLC测定注射用复方甘草酸苷中甘草酸铵含量和有关物质

摘 要：本文应用了RP-HPLC方法来对注射用复方甘草酸苷中甘草酸铵含量和有关物质进行测定。本研究选择的流动相为2%醋酸一乙睛（65：35），因为该流动相噪音小，漂移也明显，能够有效的分离甘草酸铵及其杂质。之所以会选择RP-HPLC方法，主要是因为该方法具有非常好的精密度，测定结果准确，而且具有非常强的灵敏性。随着RP-HPLC测定方法的改进，该方面会应用到其他物质的检查中。

关键词：RP-HPLC；注射用复方甘草酸苷；甘草酸铵；有关物质

注射用复方甘草酸苷属于典型的复方药剂，主要成分有甘草酸苷、甘氨酸、亚硫酸钠等。现如今，注射用复方甘草酸苷临床上主要用于治疗慢性肝病，还可以用来治疗皮肤炎、荨麻疹等。尽管该药物具有良好的治疗作用，但是如果过量服用，轻者会出现过敏症状，而严重者就会出现休克，因此要求患者要适量服用。正是因为如此，相关研究者对会注射用复方甘草酸苷中的主要成分甘草酸铵含量以及有关物质进行测定，以此保证该药物能够有良好的治疗效果，却不会出现严重的副作用。

1 仪器试验与色谱条件

WaterS2695高效液相色谱仪，WaterS2487紫外检测器，SartiousBS224电子天平。注射用复方甘草酸昔，标示规格为40mg・支-1 （哈尔滨三联药业有限公司）。甘草酸铰对照品（中国药.异，生物制品检定所，批号110731-200306），乙睛为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。色谱条件：色谱柱：SyolmetC18柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相：2%醋酸一乙睛（65：35），流速1.0mL・min-1，检测波长：256nm，柱温：30℃，进样量：20μL。在上述色谱条件下理论塔板数为4200。

2 RP-HPLC测定注射用复方甘草酸苷中甘草酸铵含量和有关物质试验

2.1 线性关系考察

研究者取注射用复方甘草酸苷对照品20mg，将其放到10ml的量瓶中，添加一定的水量，待到溶解到指定刻度，停止加水，均匀摇晃，即得到对照品储备液。研究者再对储备液进行和精确的量取，需要量取0.2mL、0.4mL、0.6mL、1.0mL、1.4mL、2.0mL储备液，将这些储备液分别放到量瓶中，量瓶容积为10mL。将这些储备液添加一定的水，稀释到相应的刻度，均匀的摇晃，即可得到实验所用的各种溶液。研究者依据上述色谱条件进行试验，并且应用进样20μL测定，将所取得的色谱图全部都记录下来，并且进行了相应的计算。结果发现，进样浓度如果始终保持在40-400μg・mL-1之间，则与峰面积保持着线性的关系，在要求的色谱条件下，按照信噪比3来进行盐酸，最终得出检测限是6.23ng。

2.2 溶液稳定性试验

取含量测定项下的同一份供试品.溶液，在上述色谱条件下，分别于0，2，4，6，8h：测定峰面积，结果峰面积的RSD为0.66%，表明溶液在8h内稳定。

2.3 精密度试验

精密称取甘草酸铵对照品约80mg，置100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，在上述色谱条件下，连续进样6次测定，结果峰面积的RSD为0.21%。表明精密度良好。

2.4 回收率试验

精密称取甘草酸昔处方量的80%，100%，120%的甘草酸钱对照品各3份，分别置预先按处方加有其他组分的100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，按“含量测定”项下方法测定，按外标法计算。低、中、高3种浓度回收率（n=3）分别为100.5%（RSD=0.9%）、99.6%（RSD=0.54%）、99.3%（（SHD=0.73%），回收率平均值（n=9）为99.8%。

2.5 破坏性试验

取除甘草酸铵的其他处方组分适量，用水溶解并稀释至刻度，未经破坏作为溶剂峰；另取注射用复方甘草酸营约相当于甘草酸钱20mg，置100mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，即得储备液。取储备液各5mL，分别加1mol・mL-1盐酸2mL、1mol・mL-1氢氧化钠溶液2mL、饱和双氧水2mL、置80℃水浴中加热8h、置强光下照射8h：分别取破坏后的溶液各20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，试验证明：甘草酸钱对酸、光、热较稳定，对碱、氧化较不稳定，降解产物峰明显增加，但各有关物质峰均与甘草酸钱分离良好，不干扰样品测定。

2.6 有关物质检查

取样品适量，加水制成200μg・mL-1的溶液作为供试品溶液，精密量取1mL置100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。取对照溶液20匹注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰时间的3倍。采用1%浓度的自身对照方法，根据样品中最大杂质、次大杂质以及总杂质的实测数据，对本品中的总杂质、最大杂质、次大杂质进行检查，结果显示，供试品溶液的色谱图有7个杂质峰，除溶剂峰外，总杂质为15.69%，最大单个杂质为6.95%，次大杂质为3.01%，结合本品稳定性研究的有关物质检查结果，符合限度要求。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

因为甘草酸苷主要是从植物中会提炼取得，而且甘草酸苷的杂质结构与其主要成分非常相像，难以辨别。借助UV图谱，研究者发现甘草酸苷的杂质吸收情况与主要成分吸收情况几乎相同，之后研究者又借助液质联用方法进行了分析，分析材料有对照组、进口以及研究者自己制成的样品，研发发现，主峰、杂质峰、大部分离子峰呈现出现来的状态基本相同，最后研究者借助紫外分光光度计记录发现，甘草酸苷最大吸收波长为256nm，此波长可以作为检测波长。

3.2 稳定性试验

研究者再对注射用复方甘草酸苷进行了加速、长期、影响因素试验。加速试验与长期试验的结果显示，注射用复方甘草酸苷每个指标都没有特别显著的变化，但是影响因素试验发现了明显变化，结果显示，注射用复方甘草酸苷在高湿环境下，有关物质比较多，正就说明注射用复方甘草酸苷在是湿润的环境下，呈现出不稳定的特点。研究者通过对注射用复方甘草酸苷进行破坏性干扰试验发现，注射用复方甘草酸苷经过氧化破坏，非常不稳定，因此该产品必须进行密闭保管，放置到阴凉地进行保管。

3.3 色谱图记录时间

研究者对注射用复方甘草酸苷进行了专属性考察，并且对注射用复方甘草酸在各种破坏条件下，得到的溶液进行了考察，考察发现主成分峰出现一直到再出现主峰，经过了保留时间的3倍时间。这就说明，从有关物质检查色谱图的记录时间开始，一直到主成分峰保留时间三倍，都能够对注射用复方甘草酸苷的有关物质展开研究，过了这个时间研究结果就会出现误差。

3.4 流动相选择

研究过程中，研究人员首先选择了醋酸一乙睛系统，对甘草酸铵及其杂质进行分析，但是分离效果并不好，并没有将主成分以及各个杂质分离开；其次选择了、乙睛一0.01mol・L-1磷酸盐系统，有没有取得预期效果，因为该流动相具有非常大的基线噪音，使得甘草酸铵的某些杂质信号被掩盖；最后选择了2%醋酸一乙睛（65：35）作为研究试验所用的流动相，因为该流动相具有非常稳定的基线，不会出现过大的噪声，而且也不会过度漂移，这使得微量杂质检测更具灵敏度。

参考文献

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