滋补脾阴方药对脾阴虚糖尿病大鼠大脑皮质内质网应激的影响

摘要：目的 观察脾阴虚糖尿病大鼠大脑皮质磷酸化（p）RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶（PERK）、真核起始因子2α-亚单位（eIF2α）、p-eIF2α、葡萄糖调节蛋白78（GRP78）的变化，探讨脾阴虚糖尿病相关认知下降发病机制及滋补脾阴方药的作用机制。方法 将大鼠随机分为对照组、糖尿病组、脾阴虚组、脾阴虚糖尿病组（病证组）、脾阴虚糖尿病+滋补脾阴方药组（治疗组）。采用高脂喂养4周联合小剂量链脲佐菌素注射方法建立2型糖尿病模型。在此基础上采用饮食不节、劳倦过度及灌服伤阴药方法建立脾阴虚糖尿病模型。治疗组给予滋补脾阴方药灌胃，其余各组给予等体积生理盐水灌胃，连续15 d，取大脑皮质。采用Western Blot、RT-PCR方法观察PERK、eIF2α、p-eIF2α、GRP78表达变化。结果 糖尿病组、脾阴虚组、病证组PERK、p-eIF2α蛋白表达及GRP78 mRNA表达较对照组增强（P

关键词：滋补脾阴方药；内质网应激；脾阴虚；糖尿病相关认知下降；大鼠

糖尿病相关认知下降（diabetes-associated cognitive decline，DACD）又称糖尿病认知功能障碍，是糖尿病中枢神经系统并发症，主要表现为轻、中度认知功能障碍。其发病机制复杂，可能与胰岛素抵抗、高血糖毒性、低血糖损害、脂毒性、炎性反应等因素有关[1]。内质网应激（ERS）参与糖尿病的发生，并与神经退行性疾病有关，但其在DACD中的作用尚不明确。

本研究通过Western Blot及RT-PCR方法观察各组大鼠大脑皮质ERS标志分子蛋白激酶样内质网激酶（PERK）、真核起始因子2α-亚单位（eIF2α）、磷酸化（p）-eIF2α、葡萄糖调节蛋白78（GRP78）的变化，研究ERS在DACD发病中的作用，探讨ERS与脾阴虚的内在联系，并评价滋补脾阴方药对其影响，以进一步明确DACD的发病机制及滋补脾阴方药的作用机制，为DACD的临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级健康成年雄性SD大鼠，体质量（200±20）g，购自大连医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（辽）2008-0002；SPF级环境饲养，温度（22±3）℃，湿度50%，明暗交替12 h。

1.2 药物

滋补脾阴方药（人参、山药、白芍、白扁豆、茯神、檀香等）和伤阴药（吴茱萸、制附子、肉桂）均一次性购自大连美罗医药公司，常规水煎，滋补脾阴方药每毫升药液中含原药材3.29 g，伤阴药每毫升药液中含原药材药1 g，过滤后4 ℃保存备用。

1.3 试剂与仪器

普通饲料：按照中华人民共和国《实验动物小鼠大鼠配合饲料》（GB14924.3-2001）进行配制，购自南京安立默科技有限公司。高脂饲料参照文献[2]配方：每1 kg高脂饲料含酪蛋白236 g、DL-甲硫氨酸3.54 g、蔗糖100 g、玉米淀粉242.62 g、麦芽糊精120 g、氢化的植物油制起酥油100 g、猪油100 g、纤维素40 g、矿物质混合物AIN-93G-MX（94046）41.3 g、碳酸氢钙4.72 g、维生素混合物11.8 g、乙氧喹0.02 g，购自南京安立默科技有限公司。Anti-p-PERK（#3179）、Anti-eIF2α（#9722）、Anti-p-eIF2α（#9721）抗体均购自Cell signaling公司；Anti-KDEL（SPA-827-D）抗体购自Stressgen公司；Anti-mouse IgG（#9310）、Anti-rabbit IgG（#9340）购自GE公司；增强化学发光（ECL）试剂盒（批号11363514910）购自Roche公司。台式高速离心机，LEGEND Mirco21R，Thermo公司；垂直电泳仪，EPS-301，GE公司；全自动荧光、化学发光凝胶成像系统，BioSpenctrum 810，UVP公司。

1.4 造模、分组与给药

大鼠适应性喂养3 d后，随机分为对照组、糖尿病组、脾阴虚组、脾阴虚糖尿病组（简称“病证组”）和脾阴虚糖尿病+滋补脾阴方药组（简称“治疗组”）5组，每组4只。采用高脂饮食4周联合低剂量链脲佐菌素（STZ）30 mg/kg腹腔注射制备2型糖尿病模型。随机血糖>16.7 mmol/L 确定为2型糖尿病模型建立成功。测定空腹血清胰岛素（FSI）以判断是否存在高胰岛素血症，口服葡萄糖耐量实验（OGTT）以判定是否存在糖耐量异常，胰岛素耐量实验（ITT）以验证是否存在胰岛素抵抗。在此基础上，采用饮食不节、劳倦过度、灌服伤阴药方法建立脾阴虚糖尿病模型，并对脾阴虚糖尿病大鼠给予滋补脾阴方药灌胃32.9 g/kg，每日1次，其余各组给予等体积生理盐水灌胃，连续15 d。通过水迷宫实验判定大鼠是否存在认知功能障碍。然后处死大鼠，取大脑皮质。具体造模方法及模型判定方法参照文献[3]。

1.5 Western Blot观察蛋白激酶样内质网激酶、真核起始因子2α-亚单位、葡萄糖调节蛋白78、磷酸化-真核起始因子2α-亚单位蛋白表达变化

取大脑皮质提取总蛋白，将制备好的蛋白样品加入10%及8%凝胶中电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭2.5 h，加入一抗（1∶800），4 ℃过夜，TBST洗膜，10 min×3，加入二抗（1∶2500），TBST洗膜，10 min×3，ECL发光显影。蛋白表达条带采用Bandscan软件进行分析，将PERK、eIF2α、p-eIF2α、GRP78 IOD值与所对应样品的β-actin IOD值进行比较，分析各蛋白表达水平。

1.6 RT-PCR观察各组大鼠葡萄糖调节蛋白78基因表达变化

以提取的RNA为模板合成cDNA，反应体系：总RNA 2 μg，Oligo（dt）12-18 primer 0.5 μL，以DEPC水补足体积到9 μL，70 ℃水浴10 min，置于冰上。加入5×First-Strand Buffer 5.875 μL，0.1 mol/L DTT 2 μL和10 mmol/L dNTP混合物2 μL，RNaseOUT 0.5 μL， Reverse transcriptase 0.125 μL，总体积为20 μL， 46 ℃水浴1.5 h，70 ℃水浴15 min后置于冰上5 min， -20 ℃保存备用。引物合成委托Takara公司完成。GRP78（348 bp）包括正义链5'-GTTCTGCTTGATGTGTG TCC-3'和反义链5'-TTTGGTCATTGGTGATGGTG-3'，β- actin（241 bp）包括正义链5'-AACCCTAAGGCCAACCGT GAAAAG-3'和反义链5'-TCATGAGGTAGTCTGTCAG-3’。以cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系见表1。蛋白表达条带采用Bandscan软件进行分析，将GRP78 mRNA的IOD值与所对应样品的β-actin的IOD值进行比较，分析GRP78 mRNA表达水平。

1.7 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件进行分析。所有实验数据用—x±s表示，多组间均数比较采用方差分析。P

2 结果

2.1 滋补脾阴方药对大鼠大脑皮质蛋白激酶样内质网激酶、真核起始因子2α-亚单位、葡萄糖调节蛋白78、磷酸化-真核起始因子2α-亚单位蛋白表达的影响

实验结果表明，糖尿病组、脾阴虚组、病证组p-PERK、p-eIF2α蛋白表达较对照组均增强（P

2.2 滋补脾阴方药对大鼠大脑皮质葡萄糖调节蛋白78基因表达的影响

观察结果显示，糖尿病组、脾阴虚组、病证组GRP78 mRNA表达较对照组均增强（P

3 讨论

内质网位于细胞核附近的胞质区域，是哺乳动物细胞重要的Ca2+贮存器，也是蛋白质合成与翻译后修饰、多肽链正确折叠与装配的重要场所。某些情况如缺氧缺血、高血糖、化学毒物等，使内质网腔Ca2+耗竭、蛋白质糖基化抑制、二硫键错配、蛋白质向高尔基体转运减少，均可致未折叠或错误折叠蛋白质在内质网腔中蓄积，使内质网功能改变，发生ERS。内质网对于代谢反应的调节是一个不可或缺的细胞器，对能量的波动十分敏感，很多营养物质的合成或阻断途径都可通过未折叠蛋白反应（UPR）来调节[4]。能量状态发生变化时可引起内质网应激的发生，触发UPR信号通路[5-6]。

正常状态下，细胞内质网膜上存在着RNA依赖的PERK、抑制物阻抗性酯酶1（IRE1）、活化转录因子6（ATF6）3种跨膜蛋白。非应激状态下，存在于内质网中的分子伴侣GRP78与这三者结合形成复合体，发生ERS时，GRP78与它们解离，进一步引起这三者的活化。GRP78是内质网中主要的分子伴侣，它属于热休克蛋白HSP70家族，相对分子量为78 000。GRP78具有三磷酸腺苷酶活性，有2个高度保守的结构域，一个是位于N末端的ATP酶结构域，另一个是C末端结合待折叠蛋白的区域[7]，其主要功能是辅助蛋白质折叠。PERK属Ⅰ型内质网跨膜蛋白，其胞浆侧羧基端的蛋白激酶活性既可使eIF2α磷酸化，又可使其自身发生磷酸化，是PERK的主要功能区；而游离于内质网内的氨基端主要是感受内质网的应激信息。发生应激时，PERK与GRP78解离后，发生自身磷酸化，并使得eIF2α磷酸化，而磷酸化的eIF2α可以干扰43 S翻译起始复合物的形成，影响核糖体60 S和40 S亚基聚合，阻止新蛋白质的合成。有研究表明，PERK与eIF2α的磷酸化是发生ERS的标志[8]。

中医学认为脾主运化，负责将体内的精微物质输送至全身。蛋白质是人体所必需的营养物质，是中医学认为的精微物质。脾阴具有阴液共有的滋养濡润功能，除了濡养自身，对其他脏腑、四肢百骸、形体诸窍也有濡养作用，是后天阴液之本。此外，脾阴与脾阳相辅相成，共同完成脾主运化及升清、统摄血液的作用。脾阴是保证脾正常发挥其生理功能的物质基础。脾阴不足，脾主运化功能失司，体内的蛋白质等精微物质不能正常转输，大量的蛋白质积于内质网内，可引发ERS。

滋补脾阴方药是根据清代吴澄《不居集》中资成汤化裁而成。全方以培补后天、滋补脾阴为立方原则，兼能补气理气、活血化瘀、化痰开窍、安神益智。该方由山药、人参、白扁豆、白芍、莲子、丹参、橘红、远志、茯神、石菖蒲等组成。课题组既往研究发现该方能明显改善衰老大鼠的学习记忆能力[9-13]，其含药血清对于β淀粉样蛋白损伤神经元及ERS损伤神经元具有保护作用[14-15]。

本研究发现，糖尿病组、脾阴虚组以及病证组大鼠大脑皮质中p-PERK、p-eIF2α蛋白表达较对照组均增加，糖尿病组、病证组GRP78蛋白表达较对照组增加，糖尿病组、脾阴虚组以及病证组GRP78 mRNA水平较对照组均增加，说明糖尿病组、脾阴虚组以及病证组大鼠大脑皮质中均发生了ERS。虽然ERS本身是细胞做出的自我保护，但是长时间的ERS最终将启动凋亡，导致神经细胞大量死亡。而治疗组与糖尿病组及病证组比较，p-PERK、p-eIF2α以及GRP78蛋白表达水平、GRP78 mRNA水平均下调，说明滋补脾阴方药具有减轻ERS的作用，从而减轻内质网的负担，在源头上避免长时间高强度的ERS可能带来的神经损伤，这也是滋补脾阴方药改善认知功能的重要作用机制。

此外，与糖尿病组比较，病证组p-PERK、p-eIF2α蛋白表达有增加趋势，说明病证组较糖尿病组ERS程度更强，提示脾阴虚可能加重了糖尿病大鼠大脑皮质中的ERS程度，这可能是脾阴虚时脾主运化功能失司导致大量的蛋白未得正常转输，积于内质网内导致的。而GRP78基因与蛋白水平的不统一，究其原因，可能是有差异的基因存在内含子，在基因修饰过程中该区域被剪切掉或由于密码子的简并性，有差异的基因最终的翻译产物是相同的。虽然我们已经发现脾阴虚DACD时发生ERS，但是ERS是把双刃剑，其在DACD中是否还发挥其他作用仍需进一步探讨，滋补脾阴方药在减轻ERS的同时是否还能通过其他机制改善脾阴虚DACD还需进一步证实。

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