农业院校分子生物学实验方法的改进和探索

摘要：植物基因组DNA提取是农业院校为本科生开设的分子生物学实验中最基础的一个实验。该实验存在操作步骤繁杂，耗时长，液氮容易引起冻伤等问题，改进后，简化了实验步骤，节约了时间，避免了因学生操作不当引起的液氮冻伤。并指出实验中应注意的问题，以确保实验安全、顺利的进行。

Abstract： Plant genomic DNA extraction is the most basic molecular biology experiment for undergraduate students in agricultural colleges， but this experiment has some questions such as complicated procedures， time-consuming and frostbite resulting from liquid nitrogen caused by the improper operation of students， which can be avoided after improvements in order to ensure the security and the smooth going in the experiment.

关键词：分子生物学；DNA提取；改进

Key words： molecular biology；DNA extraction；improvements

中图分类号：S188 文献标识码：A 文章编号：1006-4311（2015）35-0165-02

0 引言

分子生物学实验是农业院校中为农学、园艺、植保和生物工程等专业开设的一门重要的专业基础实验课，旨在提高学生的实验技能和培养学生的科研素养。DNA是遗传信息的载体，是重要遗传物质。快速提取高质量的DNA样品是进行PCR扩增、限制性酶切、Southern杂交、测序等分子生物学实验的保障[1]。因此，“植物基因组DNA提取”实验是分子生物学实验中最基础、最常用的一个实验。选择合适的方法快速提取植物基因组DNA显得极为重要。

该实验采用液氮研磨植物叶片，裂解植物细胞，再利用有机溶剂多次抽提，使蛋白质等沉淀于有机溶剂中，使核酸保留在水相[2]。实验需要配制大量的提取液，而且步骤繁杂，学生常常顾此失彼，不能在规定时间内完成实验。此外，在用液氮研磨植物叶片过程中，学生们常常会因为好奇或操作不小心造成液氮冻伤情况。鉴于此，笔者对该实验操作步骤做了些适当的调整与改进，化繁为简，缩短了实验所需时间，提取的DNA质量完全能满足后续分子生物学实验的要求，而且避免了液氮对学生们引起的冻伤；同时，在实践中总结出学生实验操作中的注意事项，减少了学生实验出错的几率，提高了学生实验教学效果。现将结果报告如下。

1 实验的基本原理

植物DNA提取方法有很多，常用的方法有CTAB法、SDS法、UREA法等，这些DNA提取方法在原理上基本一致，都是用液氮研磨植物幼叶破碎细胞，利用CTAB或SDS、UREA和β-巯基乙醇蛋白变性剂，再经加热使蛋白变性与DNA分离，在此基础上EDTA鳌合金属二价离子、氯仿的抽提使DNase对DNA的作用降到最低，经离心获得含有DNA的上清液，再用乙醇沉淀，得到生物基因组DNA。

2 实验材料、试剂和仪器

①材料：用常规方法培育的大豆植株的叶片。②试剂：CTAB、乙丙醇、无水乙醇，苯酚：氯仿，TE Buffer：异戊醇（25：24：1），氯仿。③仪器：高速离心机、恒温振荡器，恒温水浴锅。

3 原实验步骤

用液氮对大豆叶片进行充分研磨，取0.2g分装到2.0mL离心管中。在离心管中加入750uL预热的CTAB提取缓冲液，用涡旋混合器充分振荡混匀，放置在65℃水浴锅中温浴30分钟。冷却4-5分钟，加入750uL苯酚：氯仿：异丙醇（25：24：1）混合，放置水平摇床混匀20分钟，12000rpm/min离心10min。取上清液于1.5mL离心管中，加入等体积氯仿，水平摇床混匀5min，12000rpm/min离心10min。取上清，加入120uL异丙醇，12000rpm/min离心5min。弃上清，用乙醇洗涤、烘干后，用TE Buffer溶解。

4 改进后实验步骤

取大豆幼嫩叶片，用剪刀剪碎放入0.5ml离心管中。加200uL TPS提取液，用涡旋混合器充分振荡混匀，95℃加热10min，4000rpm/min离心10min。取上清，加入等体积的异丙醇混匀，12000rpm/min离心3min。弃上清，用乙醇洗涤、烘干后，用TE Buffer溶解。

5 效果评价

改进前，要用CTAB提取液、苯酚：氯仿：异丙醇（25：24：1）、氯仿反复抽提3次；改进后只用TPS提取液抽提1次。因此，改进后的实验既简化了实验步骤，又缩短了实验时间，而且通过改进后的方法提取的基因组DNA质量和数量完全能满足后续分子生物学实验的要求[3]。改进前，用液氮研磨植物叶片；改进后，用剪刀将植物叶片剪碎即可，虽然提取量会有所下降，但避免了因学生操作不当引起的液氮冻伤。

6 实验中的注意事项

①要尽可能剪碎植物叶片。用剪刀将植物叶片剪成细小部分，剪得越细，提取的DNA的量会越多。

②要充分涡旋混合样品与提取液。因为此时DNA还没有分离，涡旋混合不会破坏DNA。充分涡旋使样品与提取液混匀，不要有结块儿现象，可提高DNA的提取量。

③操作要迅速、准确。剪切样品速度要快，转移样品要完全，以避免样品损失减少DNA的提取量。

7 结论

通过分子生物学实验方法的改进，不仅提高了学生的实验技能和科研素养，还有效的缩短了实验时间、减少了学生实验出错的几率，确保了实验的安全、顺利进行，提高了教学效果。由于分子生物学技术的持续革新和教学模式的不断发展，分子生物学实验教学方法的改进成为了一项长期而艰巨的任务，教师仍要根据时代的发展和学校的特色，积极探索并完善适合本校的分子生物学实验的建设。

参考文献：

[1]詹少华，尹艺林.大豆基因组DNA提取纯化方法研究[J]. 安徽农业科学，2008，36（23）：9871-9872.

[2]王观林，方洪筠.植物基因工程[M].北京：科学出版社， 2002：744.

[3]吴艳艳，代德艳，蔡春梅.一种改良的大豆DNA提取方法[J].大豆科学，2015，34（1）：112-115.