米格列奈对内皮细胞一氧化氮合成及氧化应激的影响

[摘要] 目的 观察口服降糖药米格列奈对高糖环境下内皮细胞一氧化氮（NO）合成及氧化应激反应的影响。 方法 成功培养及传代人主动脉内皮细胞（HAECs），分为对照组（葡萄糖浓度为5.5 mmol/L）、高糖组（葡萄糖浓度为30 mmol/L）、米格列奈组（30 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L米格列奈）。ELISA法测NO、上清液中内皮型一氧化氮合酶（eNOS）及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的含量；比色法分别检测6、12、24、48、72 h上清中超氧化物岐化酶（SOD）的活力及丙二醛（MDA）的含量。 结果 ①米格列奈组24 h NO含量为（232.71±8.78）μmol/L，较高糖组低（P < 0.05），随后逐渐升高，48 h 和72 h含量[（263.48±6.32）、（270.91±6.03）μmol/L]较高糖组明显增高，差异有统计学意义（P < 0.05）。②干预24、48、72 h测米格列奈组eNOS的含量[（51.96±2.65）、（59.28±3.63）、（60.41±4.48）μmol/L]均较高糖组增高，差异有统计学意义（P < 0.05）；同步测iNOS含量[（53.28±3.45）、（62.09±3.71）、（59.90±3.60）μmol/L]与高糖组相比明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。③干预6、12、24、48、72 h测米格列奈组SOD活力[（3.99±0.46）、（5.70±0.14）、（4.98±0.37）、（3.18±0.25）、（3.35±0.51）U/mL]较高糖组高，差异有统计学意义（P < 0.05）；测MDA含量[（0.500±0.014）、（0.633±0.018）、（0.623±0.051）、（0.510±0.030）、（0.513±0.015）nmol/mL]较高糖组明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 米格列奈能减少高糖环境中动脉内皮细胞iNOS的生成，增强eNOS的活性和表达，促进内皮细胞NO的产生，同时能减轻高糖引起的氧化应激损伤。

[关键词] 米格列奈；人主动脉内皮细胞；一氧化氮；一氧化氮合酶；高血糖；氧化应激

[中图分类号] R977.15 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）09（b）-0004-03

米格列奈于1992年由Sato等首次合成，是继瑞格列奈和那格列奈后的第3个新型苯甲酸衍生物类降糖药[1]。其不仅具有速效、强效、短效降糖的特点，同时还有改善胰岛素抵抗、抗炎及抗氧化应激等作用[2-3]。有研究表明，糖尿病慢性并发症的发生与血管内皮功能紊乱关系密切[4]。本研究通过观察米格列奈对高糖环境下内皮细胞一氧化氮（NO）合成及氧化应激的影响，从而进一步探讨米格列奈对高糖环境下人主动脉内皮细胞（HAEC）活性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

HAEC及内皮细胞培养基购自于美国ScienCell研究实验室（ScienCell 6100）。胎牛血清购自于杭州四季青生物工程材料研究所。人NO、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）及内皮型一氧化氮合酶（eNOS）ELISA检测试剂盒购自于美国R and D公司。超氧化物岐化酶（SOD）、丙二醛（MDA）测试盒购自于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 分组 分为对照组（葡萄糖浓度为5.5 mmol/L）、高糖组（葡萄糖浓度为30 mmol/L）、米格列奈组（30 mmol/L葡萄糖浓度+10 μmol/L米格列奈）。

1.2.2 细胞培养 HAEC在含10%胎牛血清的培养瓶中常规培养，条件为：5% CO2 37 ℃。在HAECs达80%左右融合时用含2%马血清的DMEM培养液诱导分化成为成熟HAEC。

1.2.3 一氧化氮及一氧化氮合酶测定 按说明书制成浓度分为12.5、25、50、100、200 μmol/L的标准品稀释液，分别设空白孔、标准品孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品孔加入稀释好的标准液50 μL；在酶标包被板上待测样品孔内先加样品稀释液40 μL，然后再加待测样品10 μL（样品最终稀释度为5倍）。轻轻晃动混匀，37℃温育30 min。弃液甩干后每孔加入酶标试剂50 μL，空白孔除外。轻轻晃动摇匀，37℃温育30 min。再次弃液甩干，加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL，轻轻振荡混匀，37℃避光显色10 min。取出酶标板，每孔加终止液50 μL，终止反应。以空白孔调零，在450 nm波长下测量各孔的吸光度值（OD值）。根据标准曲线计算出对应样品浓度。

1.2.4 超氧化物歧化酶的检测 取细胞培养液，3500 r/min离心10 min，取上清0.1 mL待测。按照说明书要求加入0.1 mL试剂1摇动几下试管，再加入试剂2、3、4各0.1 mL，混匀，塑料薄膜封口，刺一小孔，37℃水浴40 min，加入显色剂1 mL，混匀，室温放置10 min，于波长550 nm处，1 cm光径比色杯，蒸馏水调零，测各管OD值，根据公式计算SOD活力。

1.2.5 丙二醛的检测 取培养液，3500 r/min离心10 min，取上清0.05 mL待测。按照说明书要求加入0.05 mL试剂1摇动几下试管，再加入0.75 mL试剂2及0.25 mL试剂3，混匀，塑料薄膜封口，刺一小孔，95℃水浴40 min，取出后流水冷却。再次3500 r/min离心10 min，取上清液，532 nm处，1 cm光径比色杯，蒸馏水调零，测各管OD值，根据公式计算上清液中MDA含量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，采用one-way ANOVA进行显著性检验，组间比较采用S-N-K检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药物干预HAECs不同时间NO的变化

以浓度为5.5 mmol/L及30 mmol/L的葡萄糖、30 mmol/L的葡萄糖+10 μmol/L的米格列奈干预HAECs，收集培养24、48、72 h的细胞上清液，ELISA法测定NO的含量。结果显示，与对照组相比，高糖组24 h NO检测值增高，且差异有统计学意义（P < 0.05），之后随着时间延长，NO含量明显减少（P < 0.05）。与高糖组相比，米格列奈组24 h NO含量降低，之后增高，48 h及72 h NO含量较高糖组高，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

表1 米格列奈对人主动脉细胞培养上清液中一氧化氮含量的影响（μmol/L，x±s，n = 5）

注：与对照组比较，aP < 0.05 ；与高糖组比较，bP < 0.05

2.2 药物干预HAEC不同时间细胞上清液eNOS含量的变化

收集培养24、48、72 h的上清液，ELISA法测定eNOS的含量。结果显示，与对照组相比，高糖组eNOS含量持续降低，且差异有统计学意义（P < 0.05）；与高糖组相比，米格列奈组在各时间点eNOS含量均显著性增高，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

表2 米格列奈对人主动脉细胞培养上清液中内皮型一氧化氮合酶含量的影响（μmol/L，x±s，n = 5）

注：与对照组比较，aP < 0.05；与高糖组比较，bP < 0.05

2.3 药物干预HAEC不同时间细胞上清液iNOS含量的变化

收集培养24、48及72 h的上清液，ELISA法测定iNOS的含量。结果显示，与对照组相比，高糖组iNOS含量增高，差异有统计学意义（P < 0.05），其中以24 h增高最明显。与高糖组相比，米格列奈组iNOS含量在各时间点均降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。

表3 米格列奈对人主动脉内皮细胞上清液中诱导型一氧化氮合酶含量的影响（μmol/L，x±s，n = 5）

注：与对照组比较，aP < 0.05；与高糖组比较，bP < 0.05

2.4 药物干预HAEC不同时间上清液中SOD活力的变化

分组干预HAEC，收集培养6、12、24、48、72 h的上清液，比色法测定SOD的活力。结果显示，与对照组相比，高糖组SOD活力显著性下降（P < 0.05）；而与高糖组相比，米格列奈组SOD活力显著增高（P < 0.05）。见表4。

2.5 药物干预HAEC不同时间上清液MDA含量的变化

分组干预HAEC，收集培养6、12、24、48、72 h的上清液，比色法测定细胞培养上清液中MDA的含量。结果显示，与对照组相比，高糖组MDA含量显著性增高（P < 0.05）；与高糖组相比，米格列奈组MDA含量显著降低（P < 0.05）。见表5。

3 讨论

血管内皮细胞（VEC）位于血流和组织之间，为衬贴于血管内腔面的单层扁平细胞，研究表明它不仅起屏障作用，还具有重要的内分泌功能，参与血管损伤的修复和免疫反应[5]，糖尿病并发症的发生和血管内皮功能的紊乱密切相关[6]。NO是内皮细胞分泌最强的血管舒张因子，NOS是其合成的限速酶，静止期的内皮细胞主要表达eNOS，催化生成低浓度的NO，用以舒张血管和抑制血小板聚集。当受到外来损伤如高糖刺激时，iNOS被激活，诱导高浓度的NO的合成，引起内皮细胞的损伤和凋亡[7]。氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，自由基的产生与抗氧化防御之间严重失衡，从而导致组织损伤。以往研究证实，氧化应激反应与糖尿病血管并发症及动脉粥样硬化关系密切[8-9]。SOD能清除超氧阴离子自由基保护细胞免受损伤。MDA则是体内脂质过氧化的代表产物之一，可以间接反映细胞损伤的程度。

本研究观察到，米格列奈组24 h NO的含量相对于高糖组是减少的，48、72 h NO的合成及释放均较高糖组高。同时米格列奈组iNOS的含量各时间点均是减少的，说明米格列奈有效抑制了高糖对iNOS的激活，有利于减少早期iNOS激活后NO大量合成对细胞造成的伤害。而米格列奈组eNOS的含量均较高糖组增高。eNOS的激活有利于低浓度NO合成的增加，有利于纠正高糖刺激后内皮细胞功能的紊乱。同时本研究观察到，高糖组SOD含量较对照组明显下降，而MDA含量显著增高，提示高糖环境下内皮细胞氧化应激反应的激活，与以往结果一致。而与高糖组相比，米格列奈组的SOD活性增高，MDA的含量明显降低，提示米格列奈对氧化应激反应有一定的抑制作用，从而对维护正常的内皮细胞功能起到有益作用。有研究认为高糖诱发的氧化应激反应可通过激活TGF-β1/PI3K/Akt途径诱导产生过多的iNOS[10]。同时氧化应激可使eNOS表达下降，减少NO生成，且超氧阴离子可与NO生成过硝酸根离子（OONO-），使NO失活。米格列奈对氧化应激反应的抑制，有利于减少早期高糖刺激的iNOS产生，适度增强eNOS表达，有利于纠正高糖损伤造成内皮细胞功能的紊乱，但具体机制有待进一步研究。

米格列奈作为新型的格列奈类降糖药，多种体内外实验均已表明其能有效降低血糖，改善糖化血红蛋白，减少低血糖事件[11]，同样也显示了其在改善血脂代谢及降低炎症因子、延缓动脉粥样硬化等方面的优势。报道证实米格列奈所结合的磺脲类受体于人的大动脉（冠状动脉、主动脉等）均存在[12]，本研究观察到其可减少高糖环境中内皮细胞iNOS的生成，增强eNOS的活性，从而适度促进内皮细胞NO的产生，同时能减轻高糖引起的氧化应激损伤，这一现象值得进一步研究。

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（收稿日期：2013-07-04 本文编辑：程 铭）