蛹虫草母种培养基配方优化研究

摘 要： 采用6种不同配方的固体培养基对蛹虫草菌株的菌丝体进行培养，以菌种初萌发时间、菌丝长速、菌丝长势、菌丝长满斜面所需时间为指标，筛选出蛹虫草母种最佳培养基。结果表明：母种培养基的最佳配方为：20%马铃薯提取液中加入1%葡萄糖、1%蛋白胨、2%琼脂、0.5%KH2PO4、0.3%MgSO4、VB1（10 mg·L-1）， pH值5.8。在该培养基上，菌种的初萌发时间最短，为2 d；菌丝长速最快，为6.3 mm·d-1；长势最强；菌丝满管时间最短，为10 d。

关键词：蛹虫草；母种培养基；配方；优化

中图分类号：S646 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.10.004

蛹虫草[Cordyceps militaris （L.）Link.]又称北冬虫夏草，北虫草，与冬虫夏草同属异种，隶属真菌门、子囊菌亚门、核菌纲、麦角菌科、虫草属，是蛹虫草真菌寄生在鳞翅目夜蛾科昆虫蛹体上形成的子座与蛹体的结合体[1-2]。蛹虫草是著名的食药用菌，具有较高药用价值，具有补肺益肾、抗疲劳、抗肿瘤、抗衰老、美容养颜等保健作用，以及显著增强免疫力的功能[3-4]。其菌体内蛋白质含量高达40%以上，氨基酸种类齐全（其中含有人体必须的8种氨基酸），并含有锌、铜、硒等多种微量元素，其维生素不但种类多，且含量极为丰富。虫草属真菌的深层培养，主要目的是大批量生产菌丝体，并从培养液中提取虫草素、虫草酸、虫草多糖、甘露醇、SOD等多种有效成分[5-6]。经中国中医研究所等权威机构检测发现，蛹虫草中各种有效成分的含量均接近甚至超过冬虫夏草。近年来，人们把人工培育的蛹虫草作为冬虫夏草的替代品，以替代天然冬虫夏草的不足。研究表明，蛹虫草的菌丝体和子实体具有基本相同的有效成分及药用与滋补功效[7]。

蛹虫草母种培养基的研究已有一些报道，但所述培养基各有不同，产量与品质也高低不一，这种情况严重影响其产业发展。在蛹虫草的母种培养中，培养基的配方是否优良，直接影响菌丝体的生长。因此，对蛹虫草母种培养基进行优化研究，筛选出适合蛹虫草菌丝体生长的最佳母种配方具有一定的理论与实际意义。本试验以不同的研究人员试验获得的6种母种培养基为基础，以菌种初萌发时间、菌丝长速、菌丝长势、满管时间为指标，筛选出母种培养基的最佳配方，以期应用于蛹虫草的生产和科学研究。

1 材料和方法

1.1 菌 种

蛹虫草试管母种由华中农业大学微生物教研室提供。

1.2 主要仪器

不锈钢立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂生产，型号：LDZX-30FB；超净工作台，苏净集团安泰公司制造，型号：SW-CJIFD；恒温培养振荡器，天津市欧诺仪器仪表有限公司生产，型号：HNY-2102。

1.3 培养基设计

根据蛹虫草生长所需营养条件及不同研究人员提供的最佳配方确定。

1.3.1 配方1 葡萄糖10 g、蛋白胨10 g、琼脂20 g、MgSO4 0.3 g、KH2PO4 0.5g 、VB1（50 mg·L-1）、蒸馏水1 L、pH值5～6。

1.3.2 配方2 葡萄糖10 g、牛肉膏10 g、琼脂25 g、MgSO4 0.6 g、KH2PO4 2 g、乙酸钠5 g、柠檬酸二胺2 g、MnSO4 0.25 g、吐温80 mL、酵母粉5 g或酵母膏10 g、蒸馏水1 L、pH值6.2～6.4。

1.3.3 配方3 蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、琼脂17 g、NaCl 5 g、蒸馏水1 L、pH值7.2左右。

1.3.4 配方4 葡萄糖10 g、琼脂20 g、MgSO4 1 g、KH2PO4 1.5 g、VB1（50 mg·L-1）、CaCO3 1 g、蒸馏水1 L、pH值5～6。

1.3.5 配方5 葡萄糖15 g、柠檬酸铵 2.5 g、琼脂20 g、乙酸钠5.5 g、MgSO4 0.65 g、MnSO4 0.3 g、KH2PO4 1.5 g、蒸馏水1 L、pH值自然。

1.3.6 配方6 20%马铃薯提取液中加入1%葡萄糖、1%蛋白胨、2%琼脂、0.5%KH2PO4、0.3%MgSO4、VB1（10 mg·L-1）、蒸馏水1 L、pH值5.8。

1.4 方法步骤

1.4.1 培养基制备、分装与灭菌 按培养基制备的常规技术，分别制作以上6种配方培养基。配方中有马铃薯者，将马铃薯削皮、去掉芽眼切块（0.5 cm×1 cm），称质量。置沸水中煮30 min，用4层纱布过滤挤压取其汁液至于烧杯中，同时加入琼脂及其它药品搅拌使其充分溶解，加水定容至1 L，测定并调整酸碱度。将制备的培养基分别装入试管中，装量为管高的1/4。每种配方装6支试管，塞上棉塞封口，捆扎。在压强1.14×105 MPa、温度120 ℃下高压灭菌30 min后，待高压锅的气压降至0，将试管取出冷却并搁置斜面，然后将其放入28～30 ℃室温中培养48 h进行无菌检验。检查完毕将其置于超净工作台中备用。

1.4.2 接种与培养 接种前将母种菌株搁置在恒温箱中活化1 d，然后菌种移入接种室，在超净工作台中按无菌操作要求，向试管斜面中央接种，接种块大小为5 mm×25 mm。注意接种块不要碰到其它部位，以免影响菌种萌发后菌丝体的观察。每种培养基配方接6支试管。接种后移入恒温箱中培养，培养条件为18.5～19 ℃，无光照。接种后每2 d记录菌落形成及菌丝生长情况。

1.4.3 测定菌丝长速 菌丝长速是菌丝生长的指标。将菌丝接种到斜面培养基中，每天测量1次菌落直径，直至菌落满管为止。观察并记录每种配方6支试管中菌丝的生长情况，重复3次取其平均值。

1.4.4 统计满管天数 满管天数是菌种接种到斜面培养基上，到菌丝布满斜面所需要的时间。观察并记录每种配方6支试管的满管时间，重复3次取其平均值。

1.4.5 观察菌种初萌发天数 从菌种接种到培养基上开始观察，到接种块周围长出白色绒毛状菌丝体，这段时间为菌种初萌发时间。从接种开始，每24 h观察并记录每种配方6支试管中菌种的萌况，重复3次取其平均值。

1.4.6 观察菌丝长势 菌丝长势是评价菌丝生长情况的重要指标。以菌丝的洁白程度、生长健壮程度、菌丝浓密程度、菌台厚度为指标，观察并记录每种配方6支试管中菌丝的长势。观察结果用很强、强、较强、弱4个等级表示。

2 结果与分析

2.1 菌丝长速

不同配方培养基上菌丝的生长速度如图1。在不同培养基上菌丝长速在4.7～6.3 mm·d-1之间。其中配方6长速最快，配方1次之，配方2最差。

2.2 菌种初萌发天数

不同培养基菌种初萌发天数如图2所示。不同培养基上菌种初萌发天数约在2 d左右，其中配方2萌发时间最长，为2.7 d；配方5为2.3 d；其他配方均为2 d。

2.3 菌丝体满管时间

不同培养基菌丝的满管天数如图3。菌丝满管时间在10～14 d之间。其中配方2满管所需时间最长，为13.4 d；其后依次为配方5、配方3、配方4、配方1，配方6所需时间最短，为10 d。

2.4 菌丝在不同配方培养基上生长情况

菌丝体在不同配方培养基上的长势如表1。配方6和配方1菌丝长势最强，菌丝洁白、浓密，菌台厚；配方3、配方4次之；配方2长势最差，菌丝稀疏，易污染，菌台薄；配方5长势稍强于配方2，但与其它配方相比长势较差。

3 结论与讨论

配方6和配方1的菌丝生长情况最好，菌种初萌发时间短，菌丝长速快，菌丝长势很强，满管时间短。其次为配方3、配方4，配方5和配方2菌丝生长情况最差。配方6菌丝生长情况稍优于配方1，由于配方6中含有马铃薯提取液，作为碳源马铃薯提取液优于蔗糖和葡糖。配方3优于配方4，配方3菌丝长速和满管时间虽然不是最快，但由于母种培养基中对菌丝的生长氮源比碳源影响大[8]，牛肉膏是最佳氮源[9]。而配方4中无氮源。配方5、配方2生长情况最差，由于配方5中只有少量柠檬酸铵作为氮源，氮源浓度不足。配方2中含有牛肉膏、柠檬酸二胺，酵母粉或酵母膏氮源丰富浓度过大，菌丝长势差。研究表明同一氮源浓度以10 g·L-1为佳[9]。

配方6含有最佳碳源及生长因子，所以菌种初萌发时间短、长速快、长势强，菌种满管时间短。牛肉膏做氮源综合指标虽然最好，但菌丝长速和满管时间并不是最快。蛹虫草生长过程中所需氮源以牛肉膏最佳，氮源浓度要适宜。

本试验是从不同研究人员所获得的6种配方中筛选的最佳母种培养基配方，至于是否还存在其它配方更有利于蛹虫草菌丝体的生长，还有待于在以后的试验中进行深入的研究和探讨。

参考文献：

[1] 刘波. 中国药用真菌[M].太原：山西人民出版社，1984.

[2] 梁宗琦，刘爱英，刘美华.我国两个寄生真菌的虫草新记录种[J].菌物系统，2003，22（1）：159-160.

[3] 郑婷婷，李多伟，王英娟.蛹虫草液体培养条件优化及有效成分含量分析[J].菌物研究，2004，2（4）：22-25.

[4] Russellr， Patersonm. Codyceps：A traditional Chinese medicine and another fungal therapeutic biofactory[J].Phytochemistry，2008，69（7）：1469-1495.

[5] 常明昌.食用菌栽培[M].北京：中国农业出版社，2009.

[6] 连云岚，杨中林.北虫化学成分及药理作用的研究进展[J].山西医药杂志，2006，35（1）：44-46.

[7] 张绪璋.北虫草的人工培植及其营养成分分析[J].中国食用菌，2003，22（2）：19-21.

[8] 徐冲，钟丽娟，赵新海，等.蛹虫草菌丝固体法培养初探[J].山东农业科学，2010（11）： 66-68.

[9] 张以俭，温鲁，葛宜和.蚕蛹虫草母种培养基研究[J].蚕学通讯，2005，25（2）：8-12.