中药血清药物化学研究进展

[摘要] 中药血清药物化学是通过口服给药后，对血中移行成分进行鉴定分析，从而快速筛选药效物质基础及揭示复方配伍规律的有效方法。在近20年的发展中，得到了众多学者的认可及普遍应用。随着血清药物化学和血清药理学、药代动力学、代谢组学、网络药理学、系统生物学等学科的交叉融合，其在沟通药物体内外变化、药物之间的相互作用、药物与机体之间的相互作用等方面体现出了较强的优越性，契合了中药配伍使用、多成分、多靶点、多种作用机制的复杂性。该文通过查阅2013―2016年CNKI Scholar 和 Pubmed 2个数据库中与中药血清药物化学相关的文献，对有关的研究成果进行了统计分析，并对血清药物化学研究中供试样品制备、实验动物选择、给药方案确定、取血方式和时间、血样制备和处理、血中移行成分分析等关键技术难题及多种解决方法进行了经验性归纳，同时，展望了中药血清药物化学的拓展及综合应用，以期为该方法在中医药研究中更好的应用奠定基础。

[关键词] 血清药物化学； 血中移行成分； 药效物质基础； 中药复方

Research progress of serum pharmacochemistry of traditional Chinese medicine

MA Feixiang， XUE Peifeng*， WANG Yuanyuan， WANG Yinuo， XUE Shuyuan

（College of Pharmacy， Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010110， China）

[Abstract] Serum pharmacochemistry of traditional Chinese medicine（TCM） is an effective method to rapidly screen the effective substances and reveal the compatibility law of compound by identification and analysis of constituents migrating to blood after oral administration. In the last two decades， it has been universally accepted and widely applied in the field. With the crossfusion with other disciplines， such as serum pharmacology， pharmacokinetics， metabolomics， network pharmacology and systems biology， serum pharmacochemistry shows comprehensive superiority in explaining drug changes in vivo and in vitro， interactions between drugs， interactions between drug and body， which coincides with the complexity of TCM compatibility， multicomponents， multitargets and multimechanisms. Based on the references related with the serum pharmacochemistry from CNKI scholar and Pubmed in 2013―2016， the research results of serum pharmacochemistry were statistically analyzed， and the key technical problems during the study of serum pharmacochemistry， for example， preparation of test sample， selection of experimental animal， determination of drug delivery scheme， method and time of the adoption blood， preparation and pretreatment of blood sample， as well as analysis of constituents migrating to blood， and the solving ways were empirically introduced. In addition， the development and comprehensive application of serum pharmacochemistry in TCM were summarized in this paper， hoping to lay a foundation for the further application of this method in TCM research.

[Key words] serum pharmacochemistry； constituents migrating to blood； effective substances； Chinese medicine compound

中是在中医理论指导下用于预防、治疗疾病或调节人体机能的药物。从古至今，中药经过数千年的临床实践，疗效确切，是维护我国人民健康的重要手段，也是中华民族传统文化的瑰宝。但由于中药化学成分和人体系统的复杂性，导致发现中药有效成分及药效物质基础、探索中药作用机制和复方配伍规律等问题很难阐明，大大阻碍了中药的科学应用和国际推广，使得中药的发展面临困境。基于此，我国学者王喜军教授经过大量实践和总结，于1997年提出了“中药血清药物化学”，即中药经口服给药后，制得含药血清，分析鉴定或表征血中移行成分，研究血中各个成分体内的变化过程，揭示药效物质基础，解析方剂配伍规律等问题的研究方法[1]。本文作者就中药血清药物化学在近年中的发展进行回顾，综述2013―2016年相关的研究成果及技术操作经验，展望中药血清药物化学与其他学科的交叉与应用。

1 研究成果及发展趋势

分别在CNKI Scholar 和 Pubmed中检索血清药物化学相关的中英文文献。所查范围为2013年1月至2016年11月，在 CNKI Scholar 以“血清药物化学”及“血中移行成分”搜索到相关中文文献208篇，Pubmed以“Serum Pharmacochemistry”检索到149篇文献。下载后，以是否建立血清指纹图谱，或是否对血中移行成分分析及鉴定为标准，使用Endnote 软件对其筛选，得到有效期刊论文93篇，相关学位论文43篇，综述21篇，见图1。

其中，共发现了959个血中移行成分，药物原型入血487个，鉴定239个；代谢新物质344个，鉴定49 个；还有128个未定性的入血成分，见图2。

综上，比较2003―2013年的论文数量、血中移行成分的分析及鉴别程度，都以成倍的速度发展，血清药物化学相关研究在近年的研究趋势可见一斑[2]。

2 血清药物化学中的关键技术

2.1 供试样品的制备

供试样品的制备多分为2种：①按中药原方配伍，以原剂型制备工艺制备，韩旭阳等[3]按原方汤剂比例将各药材称取后，其中4味药以10倍量水回流提取2次，每次1 h，合并，浓缩；后将剩余2味药以10倍量95%乙醇提取2次，每次1.5 h，合并，回收至无醇；将上述提取物合并，备用；②制备药物有效部位，王永林等[4]将杜仲的水提物经正丁醇萃取，回收溶剂后水溶，过D101大孔吸附树脂柱，收集40%乙醇洗脱部分，制得有效部位进行血中移行成分研究。

也有学者以含药血清中峰数、峰面积以及主要入血成分含量为指标，对药物的水提物、醇提物、传统剂型提取物及现代剂型提取物进行了考察，最终选定较好的制备方法[5]。

2.2 实验动物

通常依据药物的性质和适应症对实验动物的种类、性别、生理状况等进行筛选，一般以大鼠为实验对象。其中实验动物的生理状况对研究结果的影响已引起部分学者的关注，Wang等[6]分别用正常大鼠和急性血瘀模型大鼠进行大黄和酒炙大黄的血清药物化学研究。给予大黄后，发现芦荟大黄素O二葡萄糖醛酸苷和大黄素O二葡萄糖醛酸苷仅存在于正常大鼠血清。给予酒炙大黄后得到相同结果，且在正常大鼠血清中还发现了大黄酸1O葡糖苷和决明酮8O葡萄糖醛酸苷2个新的代谢产物。姚红锐等发现毛菊苣有效部位在正常大鼠中有6个入血成分，但在高脂模型大鼠中仅检测到1个微量成分。有学者认为病理模型的含药血清因更能反映药物的体内变化而更具研究价值。但在近年文献中，绝大多数学者选择正常动物作为实验对象，可能由于病理条件下机体免疫能力激活，对含药血清较正常状态下存在一定“消耗”，导致血中移行成分减少，不便于检测分析[7]。

2.3 给药方案

给药剂量一般为临床等效剂量或极限给药剂量（最大耐受量或半数致死量），可通过预实验研究确定。通常以水溶样，灌胃给药，一般大鼠的灌胃量为0.02～0.03 mL・g-1。由于药物水溶性的问题，可能使给药体积太大，导致大鼠出现呕吐不适或检测不到血中移行成分的现象。遇此情况，可将药物通过冻干粉干燥及喷雾干燥技术进行提取物浓缩，其中前者较后者要求更好的水溶性，但其回收率较后者更高。李越峰等[8]将四逆散以芍药苷等主要化合物含量为指标，制成冻干粉后给药，通过10批样品建立了血清指纹图谱，具有良好的特征性和专属性。此外，也可加入适当比例的助溶剂（CMCNa，1，2丙二醇等）制成灌胃液。刘佳丽等[9]对逍遥散乙醇提取物的石油醚萃取物进行血清药物化学研究，用1，2丙二醇水制得灌胃液，得到了可喜的研究成果。

不同研究所采用的给药次数不尽相同，通常有几下几种：①给药前12 h禁食，自由饮水，早晚各给药1次，连续给药3 d，取血备用，李永军等利用此法给药，对不同的单药[10]及复方[11]进行了血清药物化学研究；②给药前12 h禁食，自由饮水，一次性给药适量，取血备用，李广雷等[12]以此法给药，对西洋参枸杞子胶囊进行了入血成分的分析；③以原药治病原则为指导，以人服药方式及疗程为依据，对实验动物等效实施，雷志丹等[13]以临床为指导，每天1次，连续给药12 d，研究建立了舒胸片的含药血清指纹图谱；④短时间内连续给药，Wang等[14]以连续灌胃3次，每次间隔1 h的形式，对当归芍药散进行了血清药物化学研究，向青等[15]也以此形式对栝楼桂枝汤的血中移行成分进行分析，鉴定了其中16个成分。

2.4 体内样品的采集、制备、处理

2.4.1 血样采集 通过以上文献统计，总结近年血清药物化学研究中血样采集方式，见表1。

肝门静脉取血 操作较简捷，取血量较多，实验动物不能存活，适合单次取血 包含最原始吸收入血成分，也包含体循环中血液含有的成分，便于血清药物化学初探研究

腹主动脉取血 操作简单，取血量更大，实验动物不能存活，适合单次取血 血中移行成分多为代谢产物，为血清药物化学研究后期主选，如血清药理学研究、制备血中移行成分等

眼眶后静脉丛取血 取血量较少，但可多次取血，操作要求较高，检测器要求高，一般为LCMS等 可考察一段时间内，同一实验动物的血中移行成分的变化

尾静脉取血 与眼眶后静脉丛取血特点相似，但操作容易，在多次取血方面更易达到要求

由于不同药物在机体内的ADME截然不同，需根据研究目的及预实验找到具体的采血时间。李强等[16]在三黄汤的血清药物化学研究中，采用腹主动脉取血，于0.08～12 h的12个时间点进行采血，发现32个主要入血成分，鉴定和归属了其中29个成分。Zhang等[17]将刺五加灌胃给药60 min后，肝门静脉取血，发现了12个原型成分，9个代谢成分，较体外131个成分得到了快速的筛选。Fan等[18]将通脉养心丸的甲醇提取物灌胃给予大鼠，分别于给药后1 h和2 h，眼眶后静脉丛取血，通过UPLCQTOFMS检测，l现40个血中移行成分，并对其中甘草素、异甘草素、甘草酸、甘草次酸的药代动力学进行了深入研究，证明了方中桂枝对甘草中这4个成分的体内吸收起到促进作用，表明方中甘草桂枝配伍具有增效作用。卢芳等[19]采用尾静脉取血的方法对黄连1，1.5，1.75，2，2.25，2.5，3，4 h入血成分进行研究，最终发现在2 h时血中移行成分的含量达到峰值。除上述4种常用取血方法外，向文英等[20]采用股动脉取血的方法，检测到了头花蓼含药血清中的18个血中移行成分。

2.4.2 血样制备 血样通常分为血清及血浆。若需制得血浆，则需在取血管内加入适量抗凝剂（多为肝素），血清则无要求，见表2。实际研究中，为提高血中移行成分的检测浓度，减弱个体差异性，增加研究的合理性和操作性，可将同组中不同实验动物的血样混合处理[2123]。

2.4.3 血样处理 血样中含有的多种内源性蛋白严重干扰血中移行成分的检测分析，故应首先去除蛋白质。主要方法有溶剂法、酶解法、超滤法、加热法等。处理后，有时因其他内源性物质的干扰或待测组分的含量较低等原因，导致检测时干扰物质过多不便分析或未达到检测限度的现象，可通过分离纯化法进行选择性提取及富集予以解决。总结所查文献，发现近年除蛋白质的方法以溶剂法为主，分离纯化法以萃取法为主，见表3。

2.5 血中移行成分分析

血中移行成分的确认、鉴定及分析方法，多是建立在不同级别的LCUV及LCMS技术上，通过不同的分析方法得出结果。除直接将体外图谱、体内空白图谱、对照品与血样的图谱通过保留时间及一些特征性指标核对外，吴贤波等[32]采用HPLCQTOF Ⅱ技术对防风的血中移行成分采用有机溶剂沉淀 加入与水混溶的有机试剂，一般多为甲醇与乙腈，得到其上清液pH 8.5～9.5，较乙醇、丙酮等试剂影响pH小。血样与有机试剂体积比一般为1∶（1～4）时，可将97%以上的蛋白除去。离心参数：1万～14 000 r・min-1离心5～10 min[2425]

强酸溶液沉淀 加入强酸，例如不同百分比的三氯乙酸、高氯酸等，pH 0～4.0，遇酸分解的含药血样不易使用本方法。血样与强酸溶剂体积比一般为1∶0.5左右时，可将90%以上的蛋白除去。离心参数：1万 r・min-1离心1～5 min[2627]

液液萃取（LLE） 通过待测组分与干扰物质的油水分配系数不同达到分离。常用溶剂：乙酸乙酯、正丁醇等。体积比多为1∶（1～2）；操作简单，选择性强。但易出现乳化现象，可加适量中性盐减少此现象。多液液平衡后，离心制得。离心参数：1万r・min-1左右离心5 min[2829]

固相萃取（SPE） 根据待测组分的性质，选择不同分离原理的小柱填料，通过改变流动相，使药物与内源性物质在小柱的保留时间不同，选择性收集，达到分离。一般的操作流程：活化―加样―冲洗―收集。因现使用的填料多为亲脂性键合硅胶，则一般以甲醇润洗后，应用水或适当缓冲液冲洗小柱，保证回收率。加样体积大多为固定相质量的1%～3%，体积最多不可超过2 mL，流速1～2 mL・min-1，样品溶剂不能过强，以防出现“穿漏现象”，降低回收率。冲洗及收集时的溶剂体积为每100 mg固定相0.5～0.8 mL，其特点是回收率、重现性较好；可避免乳化现象等，但也因价格昂贵，技术要求高，使得现使用学者较少[3031]

主成分分析法（PCA）进行比对鉴别，分别通过Plant Medica，Chem SPIDE，MASSUNION检索出防风的原型化合物，建立其化学成分的鉴别数据库，再与实验获得的数据全部通过Mzmine 2.9软件进行标准化处理，后再以PCA分析得出5种原型成分，鉴别4种；代谢物22种，鉴定2种。董巍等[30]利用UHPLCQTOFMS对蜜炙对叶百部的血样进行采集后，采用MassLynx V4.1工作站进行扫描，后采用Waters代谢物鉴定软件MetaboLynx与建立好的数据库进行核对，表征了40个血中移行成分。Wang等[33]建立了一种以UPLCESIQTOFMS数据收集，MassLynx软件建立表征成分，后经PCA和正交偏最小二乘判别式法（OPLSDA）综合分析的方法，快速筛选鉴别目标化合物。并成功的应用到了关黄柏的血清药物化学研究中，从46个质谱峰中，快速准确的确定了其中12个原型入血成分，12个代谢成分。Yan等[34]综合利用背景减法和多数据处理方法（BsMpa）快速的归属及鉴定了双黄连方剂入血后的39个原型成分和29个代谢产物。

3 血清药物化学的方法拓展

3.1 血清药物化学血清药理学方法

近年，血清药物化学和血清药理学方法在中药的药效物质基础及作用机制研究中得到了广泛的认可及应用，但二者联用的报道甚少。唐峰等[35]利用上述结合方法探讨了麻黄附子细辛汤抗炎和免疫抑制的物质基础，首先制备15，30 min，1，2，4，6 h各时间点含药血清，通过LCMS进行血中移行成分分析，与此同时利用ELISA法及MTT法检测不同时间点含药血清的相关药理活性，最后利用逐步回归法对各成分与药理指标进行相关性分析，得出甲基伪麻黄碱、苯甲酰次乌头原碱等7个原型成分及1个未知代谢成分与其抗炎和免疫抑制的药理作用密切相关。刘菊燕等[36]也采用了类似方法，以茅苍术提取物的含药血清为实验对象，推测11个入血成分均可能为该药保护心肌细胞氧化损伤的物质基础。此类方法的特点在于均以含药血清为实验对象，确定其药效活性的同时初步判断其有效成分，将体内、外实验结合，操作过程中存在相互穿插，大大减少了实验周期，是一种有效、快速、准确的药效物质基础寻找途径。

3.2 血清药物化学网络药理学

2007年，Andrew首次将网络药理学定义为一种基于系统生物学、多向药理学及计算机辅助技术，将药物作用网络与机体生物网络整合，分析药物在网络中与特定节点或模块的相互作用关系，揭示药物与机体之间相互作用的学科[37]。网络药理学的“整体探究、系统调节”与中药“多成分、多靶点”的研究内容相呼应，在寻找中药作用靶点及药效物质基础，阐述作用机制、配伍规律等方面体现出独特的优势。血清药物化学在中药中的应用主要集中在快速筛选药效物质基础上，但对探寻作用机制需另寻他法。唐峰等[38]将血清药物化学血清药理学与网络药理学进行结合，首先利用血清药理学方法对含药血清进行药效学研究，同时对其血中移行成分进行鉴定分析，最后利用网络药理学预测靶点，初步揭示了细辛挥发油抗过敏性鼻炎的有效成分及其潜在靶点。周文斌等[39]通过血清药物化学研究确定了土家药天珠散的5个血中移行成分，并使用Discovery Studio3.5软件进行反向找靶，获得Fit value≥0.6的药效团模型861个，后通过KEGG，BIOCARTA 2 个 pathway数据库筛选到9与血管性痴呆有关的信号通路。Zheng 等[40]将血清药物化学与网络药理学等多学科相结合，建立有效组分（血中移行成分）靶蛋白网络，经代谢组学筛选生物标志物，进行通路富集分析，最终建立“基因蛋白质代谢物”层次的分子网络，通过组织病理、免疫组化技术相互验证，揭示了蒽醌类化合物（大黄酸和大黄素）和黄烷醇类化合物（儿茶素和表儿茶素）是大黄抗肾间质纤维化的药效物质基础，其作用机制是通过调节细胞外基质的异常积累，控制炎症因子的释放，保持凝血和纤维蛋白溶解平衡的协同作用发挥疗效。

3.3 中医方证代谢组学

王喜军教授继1997年血清药物化学概念提出后，根据近20年的研究实践经验，于2012年提出了中医方证代谢组学，即利用多维联用分析技术，以体液中小分子代谢物为取向探寻中医证候实质，表征证候的代谢轮廓及生物标志物；以生物标志物桥接动物模型和证候，建立反映证候本质的动物模型；以方剂对证候/模型代谢轮廓及代谢标志物的影响评价方剂整体效应，同时采用一体化研究模式，在有效状态下，分析口服方剂后体内直接作用物质及其与代谢标志物的关系，揭示方剂的药效物质基础，阐明方剂有效性及配伍规律[41]。其特点在于将血清药物化学与代谢组学整合，实现系统生物学与中医药整体观念相呼应，以“体内内源性物质药物外源性物质体内代谢物质”为媒介，并通过PCMS分析方法，确定药效物质基础，得出物质之间的变化与关联，即“中医证候生物标志物方剂体内直接作用物质药效生物标志物”，构建“中医方剂证/病整体效应调控”网络，对中医药中的“证侯和方剂”进行更深层次的阐明。王喜军课题组运用中药方证组学对茵陈蒿[42]、金匮肾气丸[43]等多个不同的复方及对应的病证进行了相关研究，并在SCI源杂志80余篇，取得了可喜的成果[44]。

4 结语

中药血清药物化学结合多种系统生物学方法，可构建体内与体外、病证与疗效的桥梁。通过HPLC图谱表征中药成分体内外动态变化，分析鉴定血中移行成分，并归属有效成分，不仅有利于中药药效物质基础的快速筛选与复方配伍规律的探索，也可通过血中移行成分性质及含量的变化，为中药的质量控制[4546]、品种鉴定[47]、炮制机制研究[6，30，48]等开辟出更广阔的研究思路，从而丰富中医药标准化、现代化、国际化研究方法。可以预见，随着血清药物化学和其他学科的融合，其在中药研究中必将发挥越来越重要的作用。

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