血必净对小鼠脑微血管内皮细胞株增殖的作用

[摘要]目的观察中成药血必净注射液对体外培养的小鼠脑微血管内皮细胞株(bEnd.3)增殖活力的影响，探讨其促进内皮损伤修复的药物效应。方法 采用小鼠脑微血管内皮细胞株bEnd.3，分别给予质量浓度为0、5、25和50mg／ml血必净刺激12、24和48h后，应用四甲基偶氮唑蓝法(MTF)检测各组细胞的增殖情况，并应用流式细胞仪检测血必净对细胞周期(增殖指数％=(G2-M)％+S％)的影响。采用单因素方差分析或非参数秩和检验进行统计学分析。结果与对照组(0mg／ml)相比，血必净5mg组和25mg组在12h和24h的MTT和增殖指数均明显升高(P

[关键词]血必净注射液；小鼠脑微血管内皮细胞；四甲基偶氨唑蒸法；细胞周期

脓毒症是重症监护病房(ICU)中非冠心病患者死亡的最常见原因，发病机制尚不十分清楚。血管内皮细胞在脓毒症发病机制中发挥着重要作用。许多证据表明，在脓毒症患者体内存在着广泛的血管内皮细胞的损伤，后者进一步导致多个器官功能的障碍和衰竭，内皮细胞损伤在脓毒症的发生和发展中发挥启动和核心作用。血必净是由天津急救医学研究所研制的一种纯中药制剂，其成份包括为红花、赤芍、川芎、丹参和当归。血必净具有对抗内毒素及细胞因子、炎性介质的作用，具有防治系统性炎症反应综合征(SIRS)和多器官功能紊乱综合征(MODS)的作用，此外，血必净注射液对内毒素损伤的内皮细胞有保护作用。本研究拟观察不同浓度质量血必净对体外培养的小鼠脑微血管内皮细胞增殖活力的影响，从而探讨血必净促进内皮损伤修复的药物效应和可能机制。

1　材料与方法

1．1材料及设备

小鼠脑微血管内皮细胞株bEnd.3购自中国科学院上海生命科学院细胞生化所，工型胶原凝胶、DMEM培养基、胎牛血清购自GIBCO BRL公司，内皮细胞生长因子购自美国BD公司，其余试剂均购于Sigma公司。用含10％热灭活胎牛血清、100mg／L内皮细胞生长添加物(ECGS)、40U／ml肝素、2mmol／L L-谷氨酰胺及含抗生素的DMEM完全培养基培养细胞，在37℃和5％CO2的恒温培养箱中培养，常规换液传代。CO2恒温孵育箱为美国REVCO，流式细胞仪为美国BD公司的FACScan，酶标仪为奥地利的Sunrise。实验用中成药“血必净”采用天津红日药业股份有限公司的血必净成品静脉注射液(10ml／支)：成分为红花、赤芍、川芎、丹参、当归，成品质量浓度为500g／L。

1．2实验方法

1．2．1药物及实验分组按照培养液中加入的血必净药物刺激浓度，将培养的细胞随机分为4组：(1)0mg／ml组(对照组)、(2)5mg／ml组、(3)25mg／ml组和(4)50mg／ml组。将细胞置于37℃和5％CO2的孵箱中培养，分别在作用12h、24h和48h后收获细胞。

1．2．2 MTT法检测细胞增殖选用生长良好的内皮细胞悬液，调整细胞浓度为2×103个／ml，接种于96孔培养板，生长培养液(80％DMEM+10％FBS)，於37℃和5％CO2，的条件培养过夜后按不同分组给药。药物作用达各预定时间点后，每孔加入四唑盐(MTT)溶液(5mg／ml)20ul，37℃，继续孵育4h，终止培养，弃去培养液，加入DMSO150μl／孔，振荡10min，使结晶物充分溶解。应用酶标仪测定各孔在490nm波长的光吸收值(OD)，结果以OD值表示细胞增殖水平，每组8复孔。试验重复3次。

1．2．3流式细胞仪检测细胞周期将生长良好的内皮细胞悬液(2×105个／ml)接种于50ml培养瓶，加入生长培养液(90％DMEM+10％FBS)，於37℃和5％CO2培养至融合状态(接种后24h)。维持液(98％DMEM／F12+2％FBS)洗脱3次，培养48h使细胞趋于静止(GO／G1期)。在各组不同血必净药物浓度条件下继续培养，分别在刺激后12h、24h和48h收获细胞，常规消化离心细胞，PBS洗涤3次后以预冷的70％乙醇4℃固定过夜。各组细胞染色前，离心去除固定液，PBS洗涤，加入200μl RNAase(1mg／ml)，37℃水浴30min，加入800μl磺化丙碇染色液(100μg／ml)，混匀，4℃下避光染色30min，流式细胞仪检测。每个样品至少测10000个细胞以上，试验重复2次。分别测定Go期／G1期、S期、G2期／M期值，计算各组的增值指数，用以代表细胞的增殖活力。计算公式为：增殖指数(PI，％)=(S+G2／M)／(GO／G1+S+G2／M)。

1．3统计学方法

所有数据均以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS13.0统计软件进行分析。均数比较先进行方差齐性检验，方差齐采用单因素方差分析(ANOVA)，多组均数间两两比较采用q检验，方差不齐则采用非参数秩和检验。以P

2　结果

2．1血必净对bEnd.3细胞增殖的影响

如表1中的MIT结果所示，与对照组(0mg／ml)相比，5mg／ml组和25mg／ml组在12h和24h具有明显刺激bEnd.3细胞增殖的作用(P0.05)；相比之下，50mg组在12h对bEnd.3细胞的增殖无显著刺激作用(P>0.05)，而在24h和48h则表现为明显的抑制作用(P

2．2血必净对小鼠脑微血管内皮细胞株bend.3细胞周期的影响

与对照组(0mg／ml)相比，5mg／ml组、25mg／ml组和50mg／ml组在12h和24h的增殖指数(H)均明显升高(P

渐增强的趋势。见图1，图2。

3　讨论

脓毒症的病理生理机制非常复杂，目前认为决定患者预后的主要是宿主反应，其中涉及到多种细胞、炎症介质和凝血因子的激活和参与。其中，血管内皮细胞在脓毒症发病机制中发挥着重要作用。内皮组织实际上是一个分布于全身的器官，数量巨大。内皮组织的作用包括调节血管张力、细胞和营养运输、维持血液流动性，以及调节局部炎症介质和抗炎介质的平衡，参与新血管生成和细胞凋亡等。脓毒症状态下，根据病原体、宿主的遗传性以及血管床部位的不同，内皮组织可以表现为不同的结构和功能的变化，以及释放一些促凝血因子、黏附因子和血管张力调节因子，从而广泛参与脓毒症病理生理过程的发生、维持和调节。因此，许多新的治疗方法将内皮细胞作为治疗靶点，这些疗法包括抗介质、抗凝、抗黏附、抗凋亡、抗NOS治疗，以及针对转录因子和信号通路的治疗等，目前这些新疗法大多数处于实验阶段。

许多证据表明，在脓毒症患者体内存在着广泛的血管内皮细胞的损伤，后者进一步导致多个器官功能的紊乱和衰竭。解剖学上的损伤包括内皮细胞的脱落和复制的增加，脱落面积可达内皮细胞总面积的25％；另外，在脓毒症动物和患者体内都检测到循环内皮样细胞(endothelial-like cell)和内皮细胞标志物，也说明脓毒症时存在明显的内皮细胞损伤。脓毒症的死亡率与循环内皮细胞的数量相关，提示内皮细胞的损失情况与多脏器功能衰竭的发生有关。因此，保护和修复内皮细胞、促进受损内皮细胞的增殖修复在脓毒症防治中有着重要意义。

血必净能够对抗细菌毒素、改善微循环以及阻断微循环障碍的病理过程。血必净是从32组中药处方中筛选出的具有对抗细菌毒素、降低内毒素水平、调节免疫及炎性介质、改善微循环、保护血管内皮细胞的有效药物。另有研究表明，血必净对内毒素造成的大鼠损伤器官超微结构有保护作用，提示其对损伤组织的保护是以对血管内皮细胞的保护为基础，从发病的病理环节上起到了对MODS的预防和治疗作用。体外研究还显示，血必净对内毒素刺激的内皮细胞具有保护作用，可缓解内皮细胞受损，且随药物浓度的增加，保护作用显著，从而可能减轻重要脏器损伤。

本实验结果表明，对于体外培养的小鼠脑微血管内皮细胞，血必净在5mg／ml和25mg／ml的药物浓度下，在作用的24h及以内有明显的刺激增殖的作用，而在作用的48h则刺激增殖的作用不明显。在50mg／ml或更高质量浓度，不但刺激增殖的作用不明显，而且随着作用时间的延长，开始出现抑制其增殖的作用。这说明血必净在一定的浓度和时间条件下对正常培养条件下的小鼠脑微血管内皮细胞具有促进增殖的作用，超出一定的浓度，则表现为抑制增殖的作用；超过一定的作用时间，这种促进增殖的作用变得不明显，从而提示血必净在促进脓毒症状态下受损内皮的增生修复方面可能具有一定价值，而且要规律应用，定时给予合适质量浓度的药物。日前国内有细胞实验的研究结果提示，血必净保护组的细胞培养液中内皮损伤标志物的浓度明显低于内毒素刺激组，从而间接提示血必净对内毒素刺激状态下的内皮细胞有保护作用。而本实验明确观察到血必净在一定质量浓度和时间条件下对内皮细胞有明显的刺激增值作用，提示血必净可能通过促进内皮细胞修复这一途径发挥对内皮细胞的保护作用。当然，正常培养条件下的内皮细胞增殖与内毒素刺激等病理情况下可能存在差异，这就需要进一步的基础实验研究来深入探讨血必净对内毒素刺激下的血管内皮细胞是否具有保护作用。