鸭梨幼果石细胞分化期Pb4CL基因表达分析

摘要：为揭示梨果实石细胞分化的机理，调控石细胞形成和含量，克隆了鸭梨（Pyrus bretschneideri Rehd. ‘Yali’）4-香豆酸∶辅酶A连接酶基因Pb4CL片段（GenBank登录号：KF177692），该片段长467 bp，经同源性比对，该片段与沙梨、欧洲花楸和枇杷等物种4CL基因高度同源，编码155个氨基酸残基，存在4CL蛋白质高度保守区域，具有腺苷酸合成class I超级结构域。建立了梨Pb4CL基因的荧光实时定量表达检测体系，在石细胞分化期Pb4CL基因相对表达量逐渐升高，后呈下降趋势。

关键词：鸭梨（Pyrus bretschneideri Rehd. ‘Yali’）；4-香豆酸∶o酶A连接酶；基因克隆；表达分析

中图分类号：S661.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）23-6267-04

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.23.066

Abstract： In order to reveal differentiation and histogenesis mechanism of stone cells in fruitlets， and regulate and control the stone cell contents， Yali pear（Pyrus bretschneideri Rehd. ‘Yali’） fruits Pb4CL fragment was cloned（GenBank number：KF177692）. Pb4CL gene fragment was 467 bp. The analysis of the sequence revealed that the Pb4CL gene was highly homologous with that of other species such as Pyrus communis， Sorbus aucuparia and Eriobotrya japonica in amino acids. The gene fragment encode postulated proteins of 155 amino acids in which the high conserved domain of 4CL protein was， like AFD_class_I superfamily. Expression system of real-time fluorescence quantitative RT-PCR for detecting Pb4CL gene was established. The relative expression of Pb4CL gene was rised during stone cell differentiation， and had a falling trend.

Key words：Yali pear（Pyrus bretschneideri Rehd. ‘Yali’）； 4CL； gene cloning； expression analysis

梨（Pyrus spp.）是世界性的重要落叶果树，是中国果树栽培的重要树种之一。梨果质脆、汁多、酸甜适口，多具芳香味，深受人们的喜爱，其食用品质受多种综合因素的影响，其中石细胞是影响梨果实品质的关键因素之一[1，2]。石细胞为厚壁细胞的一种类型，由薄壁细胞经次生壁的强烈增厚且高度木质化而来，次生壁坚硬呈同心层次[3]。木质素是石细胞次生壁的主要成分之一[4-6]，包括3种类型――对羟基苯基木质素（H）、愈创木基木质素（G）和紫丁香基木质素（S），分别为对-香豆醇（p-coumaryl alcohol）、松柏醇（Coniferyl alcohol）与芥子醇（Sinapyl alcohol）3种单体聚合，它们都是苯丙烷类衍生的类苯丙酸化合物[7，8]，来源于香豆酸羟基化和甲基化的衍生物。4-香豆酸∶辅酶A连接酶（4CL），又称羟基肉桂酸∶CoA连接酶、4-香豆酰∶辅酶A合成酶，它是苯丙氨酸代谢途径的关键酶之一，可催化香豆酸、咖啡酸和阿魏酸及芥子酸形成相应硫酯，这些中间产物可进入木质素合成特异途径，进一步合成木质素单体[9]。近年来，越来越多的学者开始关注4CL蛋白质及其基因序列，目前已经克隆了棉花[10]、烟草[11]、高粱[12]、水稻[13]等多种植物的4CL基因。该基因以小的基因家族形式存在，多具有2～4个成员[14]，且不同成员催化底物特异性存在差异，其在苯丙烷代谢途径中参与的分支途径不同。有研究发现，当4CL活性受到抑制时，拟南芥植株木质素含量会降低50%[15]，且改变了木质素的类型，说明4CL基因在调控木质素合成中也扮演了重要角色。张夏南等[16]从黄金梨果肉中克隆了10个与木质素合成相关的cDNA，经荧光实时定量分析发现Pp4CL1和Pp4CL2在幼果期表达，而在果实发育后期基因相对表达量较低。本研究以石细胞分化期鸭梨幼果为试材，克隆了4CL基因片段，并建立了相应的荧光实时定量表达检测体系，研究其在次生壁分化期的表达变化，分析其在此过程中的作用，为研究木质素与次生壁木质化的关系提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验地为河北农业大学标本园，位于河北省保定市郊区，为冲积平原潮土，黏壤，肥力中等，树龄12年生，生长结果正常，花期平均温度16.2 ℃，相对湿度30%～50%。供试材料为盛果期鸭梨（Pyrus bretschneideri Rehd. ‘Yali’）。4月初蕾期选择生长势一致的鸭梨树10棵，于花蕾大气球期在树冠的中层南部选择花蕾发育期基本一致的短果枝挂牌，每序只留第1、2朵边花。开花当日采用雪花梨花粉对其进行授粉，采集花后8、10、12、14、16、18、20 d幼果，剔去子房中心部位，液氮速冻，-70 ℃冰箱保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA的提取及cDNA合成 总RNA的提取方法参考孙雯[17]的方法并进行优化。根据TransGen公司的TransScriptTM One-Step gDNA Removal 和cDNA Synthesis Super Mix的操作说明进行cDNA的合成，产物在-70 ℃下保存备用。

1.2.2 4CL蛋白质编码基因保守区片段的克隆 根据GenBank中的沙梨（Pyrus pyrifolia）、花楸（Sorbus aucuparia）、枇杷（Eriobotrya japonica）等蔷薇科植物4CL蛋白质编码基因的保守区序列，利用Primer Primier 5.0O计上下游引物F1（5′-CGTCGCTCTAC CCTACTC-3′，5′-CTGCCTCTGTCATTCCAT-3′），由北京华大基因公司合成。反应体系为10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1.6 μL，上游引物F1（20 μmol/L）0.4 μL，下游引物R1（20 μmol/L）0.4 μL，模板cDNA 2 ng，Taq酶（5 U）0.4 μL，MgCl2 2.0 μL，加ddH2O 至25 μL。反应程序为94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，33个循环；72 ℃ 10 min。将克隆获得的产物切胶回收，与pMD19-T载体连接后转化DH5α，37 ℃过夜培养，挑取阳性克隆，经菌体PCR验证正确后送华大（北京）股份有限公司测序。

1.2.3 石细胞分化期Pb4CL表达分析 以苏雅男[18]设计的梨β-actin基因扩增引物ACT-F（5’- TTGGGATGGGTCAGAAGG-3’）、ACT-R（5’-CTGTGAGCAGAACTGGGTG-3’）作为内参引物。根据已克隆得到的4CL基因片段序列利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0软件设计实时定量PCR引物4CL-F（5’-GTGATGCTAACGCACAAGGG-3’）、4CL-R（5’-AGTGGCAGCACGCATAAGAC-3’）。并对引物进行特异性验证，扩增产物以1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。采用TaKaRa公司的SYBR-Green Real-time PCR Master Mix试剂盒，反应在Mastercycler ep realplex4 real-time PCR仪（Eppendorf，德国）上进行。反应体系为cDNA模板（50 mg/μL）1 μL、上下游引物（20 μmol/L）各0.25 μL、SYBR？RPremix ExTaqTM Ⅱ 10 μL，加ddH2O至20 μL，每个样品3个重复。反应程序为94 ℃ 1 min；94 ℃ 15 s，57.5 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，共40个循环。利用2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量。

1.2.4 生物信息学分析 序列经Vecscreen（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/）去载体后，利用NCBI）的BLAST分析程序进行比对；利用DNAMAN生物学软件对基因的氨基酸序列进行分析；并利用DNAMAN、BLAST软件搜索GenBank/NCBI/RGP中的同源序列以及编码氨基酸序列，进行同源性分析。蛋白质的保守结构域预测由NCBI的Conserved Domain Search tool（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）完成。

1.2.5 4CL酶活性测定 参照饶国栋等[19]的方法并略作调整。

2 结果与分析

2.1 4CL蛋白编码基因cDN段克隆

以鸭梨石细胞分化期幼果提取的总RNA反转录得到的cDNA为模板，采用特异性引物F1和R1进行RT-PCR扩增，电泳结果显示得到一条500 bp左右清晰的条带（图1），与预期目的片段大小一致，将该片段命名为Pb4CL。将所得产物切胶回收，纯化后，采用pMD19-T载体连接，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，菌液PCR检测鉴定阳性克隆，菌液PCR结果显示克隆片段已成功转入大肠杆菌。阳性克隆送北京六合华大基因公司测序。测序结果经Vecscreen（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/）去除载体序列。测序结果与预期结果大小相近，该片段长度为467 bp的4CL基因cDNA核苷酸序列。经DNAMAN软件分析，其最大读码框位于2～466 bp之间，编码155个氨基酸残基（图2）。

2.2 Pb4CL基因片段编码蛋白质分析

将所测鸭梨PbLAC基因序列与NCBI中收录的梨及相关近缘物种进行同源性比较，利用Blast程序在GenBank中的核酸数据进行比对分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）。鸭梨Pb4CL基因cDN段序列与沙梨（Pyrus pyrifolia，JX290374.1）、欧洲花楸（Sorbus aucuparia，GU938595.1）、枇杷（Eriobotrya japonica，EF685345.1）和树莓（Rubus idaeus，AF239687.1）等物种的同源性分别为99%、99%、96%和81%，因此证明该序列即为4CL基因序列，定名为Pb4CL，GenBank登录号为KF177692。利用在线工具ProtParam tool（http：///protparam/）对Pb4CL基因编码氨基酸序列进行分析。在所得氨基酸序列中，除Trp、Pyl和Sec外其他氨基酸均有涉及，其中Leu的含量最高，占氨基酸总数的14.8%；Val次之，占氨基酸总数的10.3%。利用DNAMAN软件对所得氨基酸序列、沙梨（GI470133579）、欧洲草莓（GI460408299）、花楸（GI508715386）等已知4CL蛋白质序列进行同源比对，同源性分别为100%、99.35%、92.6%（图3）。通过NCBI的Conserved Domain Search Tool 对其结构域进行分析，在鸭梨PbLAC基因编码的蛋白质属腺苷酸合成class I超家族，包含4CL蛋白绝对保守区域“SSTGTTG”，在该序列中具有多个CoA和AMP结合位点（图4），因此证实该基因编码的氨基酸序确实为4CL蛋白质序列，该核苷酸序列可以用于进行下一步的荧光定量分析。

利用MEGA 5.05软件对氨基酸序列进行比对，并建立了系统进化树。鸭梨Pb4CL基因编码蛋白质与另外10种植物的进化关系如图5所示。蔷薇科苹果亚科沙梨、鸭梨、花楸、枇杷分到一组，其中鸭梨和沙梨关系最近，而蔷薇亚科智利草莓、欧洲草莓和树莓分到一组，毛白杨和欧洲大叶杨分到一组。从所得氨基酸与其他植物4CL蛋白质序列分析的遗传距离得出，在植物形态学上近缘的植物类型其4CL蛋白质表现进化关系较近，说明4CL蛋白质在进化过程中存在高度保守性，也进一步验证了所得序列的可靠性。

2.3 石细胞分化期Pb4CL基因表达分析

利用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）技g，以鸭梨β-Actin为内参，分析了4CL在石细胞分化期的表达情况。在石细胞分化期，4CL表达量变化如图6所示，在开花后第10天，Pb4CL表达量略有下降，此后逐渐升高，在第14天略有下降但差异不明显，在开花后第18天出现峰值，开花后20 d开始下降。Pb4CL基因表达变化与酶活性测定相近，且在石细胞次生壁大量分化期出现明显变化，Pb4CL与石细胞分化存在一定关联。

2.4 石细胞分化期相关酶活性变化

为进一步验证石细胞分化期Pb4CL基因的表达变化，对4CL酶进行测定分析。如图7所示，在石细胞分化期4CL酶活性呈先下降后升高的趋势，鸭梨在开花第16天出现峰值，达146.0 U/g（FW），在花后20 d明显下降。对4CL活性及Pb4CL基因表达量进行相关性分析，结果表明二者呈显著正相关（R=0.801）。

3 讨论

4CL位于苯丙氨酸代谢途径的分支点上，参与类黄酮物质和木质素的合成代谢[20]，可催化香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、芥子酸等与CoA形成相应的辅酶A酯，而后者则可进入苯丙烷类分支途径通过还原反应生成木质素单体，因此4CL是木质素合成的限速酶之一[21]。目前，已在水稻[13]、棉花[10]、高粱[12]、沙梨[16]等物种上分离到4CL基因。本研究中克隆了鸭梨Pb4CL基因片段，通过与GenBank中收录的4CL基因序列进行同源性比对，该片段与沙梨、枇杷等蔷薇科植物4CL基因同源性极高。通过Pb4CL编码氨基酸序列分析，发现其具有“SSTGTTGLPKGV”结构域[14]，而该结构域同是所有植物4CL蛋白质的绝对保守区域，此外在该氨基酸序列中，具有多个CoA和AMP结合位点。从氨基酸序列的进化关系来看，鸭梨Pb4CL编码蛋白质与沙梨等蔷薇科物种蛋白质遗传距离最短，说明4CL蛋白质在进化中具有保守性，也进一步证实该片段编码序列为鸭梨4CL蛋白质序列。

研究证实，在美洲山杨中Pt4CL1参与木质素形成，Pt4CL2参与类黄酮生物合成[21]，Lee等[22]通过反义基因技术抑制拟南芥中的4CL酶活性，拟南芥木质素组分紫丁香基木质素显著增加，总木质素含量显著下降。Sun等[20]研究发现在水稻中，4CL主要以4-香豆酸和阿魏酸为底物参与木质素的单体合成。在多项研究中均证实4CL蛋白质参与木质素的合成[14，23]，王斌等[24]认为套袋可降低PAL、C4H、4CL和CAD的活性，使中间产物含量降低，从而抑制石细胞的产生。鸭梨Pb4CL基因的表达变化与鸭梨幼果石细胞分化期4CL酶活性变化相近，说明本研究建立的荧光实时定量表达检测体系能够反应4CL蛋白质的活性变化。由于鸭梨石细胞出现于花后2周，并在此后大量出现，本研究中克隆的鸭梨Pb4CL基因表达量在石细胞分化期出现上调表达，与石细胞次生壁出现的时期一致，此时木质素大量积累，说明在梨石细胞分化期4CL参与了石细胞次生壁的形成。在开花后20 d大量石细胞次生壁已经初步形成，仅在石细胞团外部有部分细胞继续分化，这可能与后期Pb4CL基因表达量出现下降有关，其结果有待于进一步研究。

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